곡류 육성 품종 총 80점(밀 40점, 보리 20점, 벼 20점)의 종자 각 100 g을 국립식량과학원으로부터 분양받았다(Table 1, Supplementary Table 1). 각 품종별 종자는 실험용 도정기(Fujiara JP/VP-30T, Japan)로 도정비율 10%으로 도정하여 외피부분(밀기울, 맥강, 미강) 약 10 g을 얻었으며 이를 페룰산 추출 시까지 ‒20°C에 보관하였다.

시료의 페룰산 함량은 Tilay 등의 분석법(2008)에 따라 분석하였다. 40°C 오븐에서 12시간 건조한 bran 시료 중 2 g을 250 ml 플라스크에 담은 후 NaOH (2 N) 60 ml과 sodium bisulfite 0.001 g을 추가하여 180 rpm에서 24시간 진탕 배양하였다. 배양액은 6,000 rpm, 4°C에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 분액깔대기에 옮겨 HCl (10 N)을 추가하여 pH 2 이하로 조정한 후 상층액을 분리하였다. 이 과정을 3회 반복한 후 회전농축기(Eyela DPE-2120, Shanghai, China)로 농축한 후 농축액을 acetonitrile:water (1:1, v/v) 3 ml에 용해하여 냉장보관하였다. 페룰산은 high-performance liquid chromatography (Waters Acquity UPLC H-Class, Waters, Singapore)로 분석하였으며 ACQUITY UPLC HSS C18 1.8 um (2.1×100 mm) 컬럼을 사용하였고 이동상은 1% acetic acid solution (A 용액)과 acetonitrile (B 용액)을 순차적으로 사용하였다.

페룰산 함량이 다양한 밀(W1, W6, W17, W26, W35, W39, W40)과 보리(B1, B2, B5, B8, B14, B19, B20) 각 7품종씩 총 14종을 선정하여 온실에서 품종별 5포트(4‒5 종자/포트)에 재배하였다. 이들의 개화기에 실험실에서 보유하고 있는 붉은곰팡이 균주 4종을 Jang 등의 방법(2019)에 따라 각각 다른 포트에 심어진 품종별 5개의 이삭에 분무 접종하였다(포자농도 1×10⁵/ml). 접종 균주는 DON 생성균인 F. graminearum PH1, F. graminearum Z34, F. asiaticum W1d와 NIV 생성균인 F. asiaticum #73이었다. 접종 후 3주후에 접종 이삭을 수확하여 병원성(%=병든 낟알수×100/총 낟알수)을 측정하였다.

수확한 이삭은 건조한 후 Jang 등의 방법(2018)에 따라 액체크로마토그래프 질량분석기(Waters e2695 separation module-Water 3100 MS detector, Waters) 를 이용하여 DON과 NIV의 발생량을 분석하였다. 컬럼은 Zorbax SB Aq C18 (4.6×150 mm, 5 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하였고, 이동상 용매는 0.2% formic acid와 5 mM ammonium formate가 첨가된 물(A)과 100% 메탄올(B)을 농도 구배(gradient) 조건으로 사용하였다.

밀과 보리 간 병원성과 독소 생성량의 평균 간 비교를 위해 엑셀 도구의 t-검정(P<0.05)를 실시하여 유의성 검증을 수행하였다.

보리, 밀과 벼 육성 품종 80종의 페룰산 함량은 Table 1에 나타내었다. 이들 곡류의 페룰산 함량은 보리 20품종이 1.66‒2.77 mg/g, 밀 40품종이 0.56‒1.53 mg/g이었으며 벼는 보리와 밀의 중간 수준인 0.91‒2.13 mg/g이었다. 밀의 경우 기존에 보고된 23개 품종의 페룰산 함량 평균이 1.158 mg/g으로 이 연구의 결과와 유사하였다(Stuper-Szablewska 등, 2016). 그러나 페룰산이 가장 많이 존재하는 과피와 호분층을 비교할 때 밀이 보리보다 페룰산 함량이 높다는 기존의 보고(Boz, 2015)와 달리 이 연구에 사용한 국내산 밀 품종은 보리품종보다 함량이 낮았다.

밀과 보리에서 페룰산 함량이 다양한 14품종을 대상으로 4종의 붉은곰팡이를 접종 한 결과, 전체적으로 페룰산 함량이 높은 보리의 붉은곰팡이 병원성 평균이 페룰산 함량이 낮은 밀에 비해 유의하게 높았다(P=0.007) (Table 2, Fig. 1). 모든 균주에서 병원성과 페룰산의 상관관계는 r2=0.5 내외로 낮았다(Table 3). 밀 품종에서 페룰산 함량과 병원성 상관관계는 이보다 더 낮았지만 보리에서는 음의 상관관계(r2=‒0.46)를 보였는데 이는 F. asiaticum 균주(w1d)의 보리 병원성과 페룰산 함량이 예외적으로 높은 음의 상관관계(r2=‒0.89)였기 때문인 것으로 보인다. 그러나 전체적인 병원성 평균은 페룰산 함량과 낮은 양의 관계(r2=0.57)였으며 이는 밀과 보리 중 페룰산 함량이 낮을수록 붉은곰팡이 병에 저항성인것으로 해석할 수 있다. 이 결과는 페룰산과 붉은곰팡이 간에 음의 상관관계가 있다는, 즉 페룰산 함량이 높을수록 붉은곰팡이병에 저항성이라는 기존의 보고와는 반대된다. 옥수수 이삭썩음병원균인 F. graminearum을 옥수수에 접종했을때 병원성과 페룰산 함량간에는 음의 상관관계 (r2=‒0.70)가 있다고 보고되었기 때문이다(Assabgui 등, 1993; Bily 등, 2003). 그러나 밀과 보리 등 옥수수를 제외한 다른 작물에서는 아직까지 페룰산과 붉은곰팡이병 저항성에 대한 보고가 없었다. 이 연구에서는 옥수수를 포함하지 않아 기존의 결과를 검증할 수 없으나 왜 맥류에서는 페룰산이 붉은곰팡이에 저항성이 아닌지 옥수수와의 비교를 포함한 추가 연구가 필요하다.

곰팡이 독소도 페룰산 함량이 높은 보리에서 생성량이 높았다. NIV의 생성량은 보리에서 유의하게 높은(P=0.025) 반면 DON은 유의차가 없었다(Table 4, Fig. 2). 이 결과는 붉은곰팡이병과 마찬가지로 페룰산 함량이 낮은 밀에서 붉은곰팡이독소 생성량이 낮은 것을 의미한다. 그러나 보리 품종 내에서 NIV 생성량은 페룰산 함량이 증가함에 따라 감소(r2=‒0.74) (Table 3) 경향을 나타냈고 NIV 생성균주와 같은 F. asiaticum 종인 w1d 균주도 보리에서 DON 생성량이 페룰산과 음의 상관관계(r2=‒0.63)를 보였다. 이는 각각 단일 균주의 결과이기 때문에 추가 균주를 이용한 확인이 필요하다. 이렇게 F. asiaticum 균주의 병원성과 독소생성이 보리에서 페룰산 함량과 음의 관계를 보이는 것은 F. graminearum 또는 밀과 구별되는 결과이다. 반면 F. graminearum 균주의 결과는 일관성이 없었다. 이 결과는 페룰산 함량이 DON 생성에 영향을 미치지 않는 것으로 볼 수 있으며 옥수수에서 F. gra-minearum의 DON 생성과 페룰산 간에는 상관관계가 없었다는 기존의 보고와 유사하다(Bily 등, 2003). 하지만 붉은곰팡이 F. culmorum 연구에서 페룰산은 곰팡이독소 생성을 저해하였다고 보고되었다. Boutigny 등(2009)은 페룰산이 0.1‒1 mM 농도로 함유된 배지에 F. culmorum을 배양했을 때 독소 생합성에 관여하는 Tri 유전자 발현이 저해되었고 B형 트리코쎄신의 합성은 17‒78% 감소하였다고 보고하였다. 다른 연구에서는 페룰산이 0.5 mM 포함된 배지에서 F. culmorum의 DON 생성이 약 67% 감소하였다(Pani 등, 2014). 이상의 결과는 페룰산을 균주에 직접 처리한 결과로서 페룰산이 F. culmorum 균주의 독소 생성을 직접 저해한다는 것을 보여준다. 반면 이 연구에서는 붉은곰팡이(F. graminearum, F. asiaticum)와 페룰산 간의 관계를 작물에서 품종간에 비교함으로써 확인하고자 하였으며 밀과 보리의 페룰산은 붉은곰팡이와 독소 생성을 저해하는 것이 아니라 오히려 증가와 관련이 있는 것으로 나타났다. 한편 곰팡이독소 저해효과를 나타내기 위해 페룰산을 처리할 때는 고농도가 필요한 것으로 보고되었다. 붉은곰팡이와 달리 F. verticil-lioides와 F. proliferatum에서 저농도(1‒10 mM)의 페룰산은 푸모니신 생성을 증가시켰으나 고농도(10‒25 mM)는 감소시켰다(Ferrochio 등, 2013).

이 연구는 곡류의 페룰산 함량과 붉은곰팡이와 그 생성독소의 관계를 밀과 보리 품종에서 분석한 최초의 보고이다. 페룰산 함량을 기준으로 밀과 보리를 비교했을 때 페룰산 함량이 낮은 밀이 높은 보리보다 붉은곰팡이 병원성과 독소(DON과 NIV) 생성량이 낮았다. 그러므로 페룰산은 맥류에서 F. graminearum과 F. asiaticum에 의한 붉은곰팡이 병원성과 곰팡이독소 생성에 저항성 요인으로 작용하지 않으며 따라서 붉은곰팡이와 붉은곰팡이독소 저항성 맥류 품종 개발을 위한 육종 소재 선발의 지표가 될 수 없는 것으로 보인다. 한편, 붉은곰팡이병과 독소 생성이 밀보다 보리에서 모두 높았던 것은 보리가 붉은곰팡이에 더욱 취약한 작물임을 암시한다. 밀과 보리 간에 다른 결과가 도출된 것은 국내 재배기간이 밀보다 긴 보리와 국내 곡류의 우점 붉은곰팡이인 F. asiaticum의 오랜 기간 동안 공진화한 결과로 추정되나 추가 연구를 통한 증명이 필요하다.