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Res. Plant Dis. 2025;31(1):125-129

Publication date (electronic) : 2025 March 31

doi : https://doi.org/10.5423/RPD.2025.31.1.125

Miju Jo^1,2,†, Sunmin An^1,2,†, Da Som Kim³, Won-Jae Chi^3,, Sook-Young Park^1,2,

¹ Department of Plant Medicine, Sunchon National University, Suncheon 57922, Korea

² Interdisciplinary Program in IT-Bio Convergence System (BK21 plus), Sunchon National University, Suncheon 57922, Korea

³ Species Diversity Research Division, Biodiversity Research Department, National Institute of Biological Resources, Incheon 22689, Korea

조미주^1,2,†, 안선민^1,2,†, 김다솜³, 지원재^3,, 박숙영^1,2,

¹ 순천대학교 식물의학과

² 순천대학교 IT-Bio 융합시스템(BK21 plus) 협동과정

³ 국립생물자원관 생물다양성연구부 생물종다양성연구과

^∗Corresponding author W.-J. Chi Tel: +82-32-590-7467 Fax: +82-32-590-7250 E-mail: wjchi76@korea.kr

S.-Y. Park Tel: +82-61-750-5187 Fax: +82-61-750-5187 E-mail: spark@scnu.ac.kr

†These authors equally contributed.

Received 2025 March 4; Revised 2025 March 13; Accepted 2025 March 13.

Abstract

Trans Abstract

세계 인구의 증가에 따라 농산물 안보에 대한 관심이 높아지고 있다(Ray 등, 2013). 또한, 인간의 건강과 환경을 보호하기 위해 시행된 농약 허용 물질 목록 관리 제도(positive list system)로 인해 화학 농약의 사용이 제한되면서 생물학적 방제의 필요성이 대두되고 있다(Kim 등, 2024). 생물학적 방제는 미생물 또는 미생물이 분비하는 물질을 이용하여 환경에 미치는 영향을 줄이고 농작물의 생산성을 향상시키는 방법으로 주목받고 있다. 식물 병원균을 억제하기 위한 길항 미생물로 연구되는 대표적인 균주로는 Streptomyces 속, Bacillus 속, Trichoderma 속 등이 있다(Ghazanfar 등, 2018; Gomaa, 2012; Trejo-Estrada 등, 1998).

이 중, Streptomyces 속은 토양에 풍부하게 존재하며 다양한 이차 대사산물과 효소를 분비하여 여러 식물 병원균을 억제하기 위한 생물학적 방제제로서 꾸준히 연구되고 있다(Khan 등, 2023). 국내에 보고된 식물 병원균 중 64.8%가 곰팡이로 알려져 있으며(Choi 등, 2024), 농산물의 곰팡이병 발생은 기후 변화에 따라 증가할 것으로 예상되고 있다(Yoon 등, 2014).

밀은 전 세계에서 재배되는 주요 식량 작물로, 국내 재배면적은 9,536 ha이며, 그중 전라북도(3,268 ha)와 전라남도(3,105 ha)가 가장 넓은 재배면적을 차지하고 있는 것으로 조사되었다(Statistics Korea, 2024). 이전 연구에 따르면, 국내 맥류 재배 환경 및 기후 변화에 따라 2009-2010년 동안 전북에서 Ceratobasidium cereale에 의한 밀 잎집눈무늬병 피해가 보고되었다(Lee 등, 2011). 또한, 최근 보고에 따르면 2020-2021년도에 전남 지역에서 발생한 맥류 곰팡이병 중 가장 높은 비율인 42.4%가 C. cereale에 의한 잎집눈무늬병으로 보고되었다(Jeong 등, 2024).

C. cereale는 전 세계에 분포하며, 밀 외에도 보리를 포함한 맥류와 벼의 잎집에 눈무늬병을 일으키는 병원균으로 알려져 있다(Hamada 등, 2011). C. cereale는 주로 토양을 매개로 발생하며, 지제부에 눈 모양의 흰색 및 회색 병반을 형성한다. 심한 경우에는 지제부의 줄기를 고사시켜 경제적인 피해를 초래하는 것으로 알려져 있다(Park 등, 2012). 본 연구에서는 잎집눈무늬병을 일으키는 C. cereale에 대한 억제 효과를 가진 Streptomyces 균주를 선발하여, C. cereale를 친환경적으로 방제하기 위한 생물학적 방제제로서 Streptomyces 균주의 가능성을 검정하였다.

잎집눈무늬병 C. cereale 균주는 농촌진흥청 농업유전자원센터(https://genebank.rda.go.kr)에서 KACC 49887을 분양받아 본 연구에 사용하였다. 잎집눈무늬병 KACC 49887 균주는 감자 한천 배지(potato dextrose agar [PDA]; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)에 옮겨 25 ^o C에서 배양하였으며, 5-7일 동안 배양한 배양체를 실험에 사용하였다. 장기 보존을 위해 멸균 토양 보존법을 사용하였다(Sinclair와 Dhingra, 2017). 멸균 토양 보존법은 원예용 상토(Punong, Gyeongju, Korea)를 121 ^o C에서 60분 동안 멸균한 후, 하루 뒤 앞선 조건과 동일하게 멸균하여 15 ml tube (50015, SPL ^TM; SPL Life Sciences Co., Pocheon, Korea)에 총 2 g을 넣어 준비하였다. C. cereale KACC 49887 균주의 7일 배양체 5개 조각(직경 5 mm)을 준비한 멸균 토양에 접종한 후, 25 ^o C에서 7일간 배양하고 4 ^o C에 보관하였다.

생물학적 방제제 후보군 선정을 위해 국립생물자원관에서 수집 및 보관 중인 13개 균주를 분양받았다(Table 1). 실험에 사용된 13개 균주는 2022년 4월 20일 강원특별자치도 태백시 대덕산의 나무 아래 토양에서 분리되었다. 4개 균주(C2-1, C2-2, C2-4, C2-5)는 학명이 특정되지 않은 활엽수의 근권 토양에서 분리되었으며, 9개 균주(C3-1~C3-9)는 팥배나무 (Sorbus alnifo-lia (Sieb. et Zucc.) K. Koch)의 근권 토양에서 분리되었다. 균주의 동정은 세균 동정의 분자 마커인 16S rRNA 영역의 염기서열 분석을 통해 이루어졌다(Supplementary Material 1). 염기서열을 미국 국립생명공학정보센터(National Center for Biotech-nology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Basic Local Alignment Search Tool 검색 결과 Streptomyces 속에 속한 균주는 총 11개였으며, 2개 균주(C2-2, C3-2)는 Kitosatospora 속에 속하는 균주였다(Table 1).

Table 1.

Isolates used in this study and inhibitory effect of the isolates on the mycelial growth of Ceratobasidium cereale

Streptomyces spp. 및 Kitosatospora sp. 균주들은 C. cereale 와 마찬가지로 PDA 배지를 사용하였으며, PDA 표면 전체에 획선 도말하여 28 ^o C 배양기에서 배양하였다. 균주의 장기 보존은 PDA 배지에서 7일간 배양한 후 형성된 포자를 80% 글리세롤로 수거하여 멸균된 2 ml cryo-vials (Cryo.s 2 ml; Greiner bio-one, Kremsmuster, Austria)에 넣고 -80 ^o C에서 보관하였다.

C. cereale에 대한 항균 활성 검정은 Streptomyces spp. 및 Kitosatospora sp. 균주와의 대치 배양을 통해 C. cereale의 균사 생장 억제력을 평가하는 방식으로 진행하였다. Kunova 등(2016)에 따르면, Streptomyces 속은 공중 균사를 형성한 후 포자를 생성하며, 이 과정에서 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 이 보고를 바탕으로 최적의 결과를 얻기 위해, 대치 배양 전에 Streptomyces 및 Kitosatospora 균주를 각각 PDA 배지에 3일 먼저 접종하여 활성화한 후, 3일 뒤에 C. cereale를 접종하였다.

균사 생장 억제력을 통한 항균 활성을 검정하기 위해, 먼저 대량 실험 방법을 통해 1차 선별을 진행하였다. 150 ml의 PDA 배지를 포함한 240×240 mm 크기의 square dish (10245, SPL ^TM; SPL Life Sciences Co., Pocheon, Korea)에 11개의 Streptomyces spp. 균주와 2개의 Kitosatospora sp. 균주를 각각 접종한 후, 3일 뒤에 C. cereale를 접종하였다. 접종원으로 사용된 13개 균주와 C. cereale는 각각 PDA에서 7일간 배양한 후, 직경 5 mm의 균사 플러그를 이용하였다. 13개 균주와 C. cereale는 35 mm 간격으로 접종되었다. 대치 배양 후 25 ^o C에서 6일 동안 배양한 후 Streptomyces sp. 또는 Kitosatospora sp.의 배양체 끝에서부터 C. cereale의 말단 균사까지의 길이를 측정하여 균사 생장 억제율을 계산하였다. Streptomyces sp. 또는 Kitosatospora sp.에 의한 C. cereale의 균사 성장 억제율(%)은 다음과 같은 수식으로 계산하였다: I (%) = (Rc – Rt / Rc) × 100. I (%): 균사 성장 억제율; Rc: 대조군 C. cereale 균사 생장의 반경; Rt: 실험군 C. cereale 균사 생장의 반경(mm).

1차 선별 실험 결과, C. cereale에 대한 균사 억제 효과를 보인 균주는 총 7개(C3-8, C3-5, C2-4, C3-1, C2-5, C2-1, C2-2)였으며, 나머지 균주들은 어떠한 억제 효과도 나타내지 않았다(Table 1). 이 중 4개 균주(C2-4, C3-5, C3-8, C3-1)는 Duncan의 다중검정법 (P<0.05)에 의해 가장 높은 억제 효과를 보이는 그룹으로 분류되었다(Table 1).

첫 번째 실험 결과를 바탕으로, C. cereale에 대한 균사 억제 능력이 가장 높았던 3개의 균주(C2-4, C3-5, C3-8)를 2차 선별 실험에 사용하였다. 20 ml의 PDA 배지를 포함한 90 mm petri dish (10090, SPL ^TM; SPL Life Sciences Co., Pocheon, Korea)에서 대치 배양 실험을 첫 번째 스크리닝 실험과 동일하게 수행하였다. 다만, C. cereale는 PDA 배지 중앙에 접종하였고, Streptomyces sp. 균주는 C. cereale로부터 4 cm 떨어진 3곳에 접종하였다. 균사 저지대는 25 ^o C에서 배양한 후 8일 경과한 시점에 측정하였다. 실험은 3반복하여, 총 3회 수행하였다.

저지대 측정 결과, 대조군에서는 C. cereale의 균사가 전체 petri dish를 뒤덮은 반면, Streptomyces sp. C2-4는 C. cereale의 균사 생장을 34.3%±2.9% 억제하여 가장 높은 균사 억제 효능을 나타냈다. Streptomyces sp. C3-5와 C3-8은 각각 20.0%±2.9%와 14.3%±0.0%의 저지대를 형성하였다(Fig. 1A, Table 1). 통계 분석은 SPSS 프로그램 버전 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 Duncan의 다중검정법을 사용하여 수행하였으며, P<0.05를 기준으로 유의성을 검정하였다.

Fig. 1.

Screening of the medium-based antifungal activity of three Streptomyces sp. against Ceratobasidium cereale and the in vivo biocontrol efficacy of Streptomyces sp. C2-4 against C. cereale in wheat seedlings. (A) Dual culture assay of the selected three Streptomyces spp. (C2-4, C3-5, and C3-8). An uninoculated empty PDA plug (5 mm) was used as the negative control. The photograph was taken 8 days after the dual culture. Microscopic observations of mycelia from C. cereale are shown in the black (B, C) and red (D, E) box areas of Fig. 1A. (F) The control was treated with uninoculated empty PDA plugs on wheat seedlings as a negative control. (G) The positive control was inoculated solely with C. cereale, the pathogen responsible for sharp eyespot disease, on wheat seedlings. (H) The treatment involved the simultaneous inoculation of both the pathogen C. cereale and Streptomyces sp. C2-4 on wheat seedlings. The photograph was taken 10 days after the treatments were applied.

대조군의 C. cereale 균사 말단과 Streptomyces sp. C2-4와 대치 배양된 C. cereale 균사의 말단을 Zeiss Axio Imager A1 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 통해 관찰하였다. 관찰 결과, 대조군에서는 전형적으로 생장하는 C. cereale의 균사를 확인할 수 있었다(Fig. 1B, C). 이에 반해, Streptomyces sp. C2-4와 대치 배양된 C. cereale의 저지대 말단에서 관찰된 균사는 해리되어 분해된 형태를 보였으며(Fig. 1D), 확대 관찰 시 세포질 내부에 동그란 형태의 원형질체가 가득 차 있었다(Fig. 1E). 이는 Streptomyces 속과 곰팡이를 대치 배양하였을 때 곰팡이 균사 내 소포가 거대해지고 세포질이 소실되는 형태학적 변화가 나타났다는 선행 연구 결과와 유사하였다(Loqman 등, 2009).

억제 효과가 가장 높은 Streptomyces sp. C2-4를 선발하여, 기주 식물인 밀에 병원균 C. cereale를 접종한 발병 조건 하에서 방제 효과를 나타내는지 여부를 검정하였다. 밀 품종 ‘백강’ 종자를 70% 에탄올과 1% NaClO에 각각 1분과 20분씩 처리하여 표면 소독한 후, 멸균수로 세척하였다. 직경 90 mm의 petri dish에 멸균된 탈지면과 페이퍼 타올을 놓고, 멸균수를 10 ml 를 부어 적신 후 멸균된 종자를 치상하였다. 이후 20^oC에서 명/암조건 12/12시간으로 2-3일 발아시켜, 지상부 길이가 3 cm인 유묘를 실험에 사용하였다.

125×125 mm 크기의 square dish (1211125, SPL ^TM; SPL Life Sciences Co.)에 80 ml의 1.5% 한천을 포함한 Murashige and Skoog (MS) 배지(M0222; Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)를 준비한 후, 멸균된 셀로판지(120×120 mm)를 위에 올려놓았다. MS 배지 중앙에 유묘를 3 cm 간격으로 총 3개 배치하였다. 음성 대조군으로는 아무것도 접종되지 않은 직경 5 mm의 PDA 플러그를 유묘 바로 아래 35 mm 거리에 총 3개 접종하였으며, 양성 대조군으로는 7일 배양한 직경 5 mm의 C. cereale 균사 플러그를 동일하게 접종하였다. 실험군은 기주 식물에 병원균을 접종하기 3일 전에 먼저 Streptomyces sp. C2-4를 접종한 후, 양성 대조군과 동일한 방식으로 처리하였다. 실험이 수행된 후, 25 ^o C의 배양기에서 10일 동안 병 발생을 관찰하였다.

그 결과, 음성 대조군에서는 밀이 건강한 상태로 아무런 증상이 관찰되지 않았다(Fig. 1F). C. cereale만 처리된 양성 대조군에서는 밀의 잎집에 눈모양의 병반이 관찰되었으며, 흰색의 솜털 같은 균사가 형성되었고, 줄기와 뿌리가 갈변되며 고사하였다(Fig. 1G). 반면, 실험군인 병원균 C. cereale와 Streptomyces sp. C2-4를 함께 접종한 경우에는 밀에서 잎집눈무늬병이 발병하지 않았다(Fig. 1H). 이 실험 결과는 Streptomyces sp. C2-4가 밀 잎집눈무늬병의 생물학적 방제제 후보균임을 시사한다.

Streptomyces 속은 이차 대사산물과 키틴 분해 효소(chitin-ase), 셀룰라아제(cellulase), 단백질 분해 효소(protease)와 같은 가수분해 효소를 분비하여 식물 병원성 미생물을 억제하는 데 활용된다(Lee 등, 2020). 항곰팡이 화합물과 키틴 분해 효소를 생성하는 Streptomyces sp. 균주 HU2014의 경우 대치 배양 실험에서 C. cereale와 접촉하지 않고도 균사 생장을 억제하였으며, 밀 잎집눈무늬병을 억제하는 것으로 보고되었다(Zhu 등, 2023). 본 연구에서 C. cereale에 대해 생장 억제 효과를 보인 Streptomyces sp. C2-4는 다양한 항균 물질 및 가수분해 효소를 통해 항균 효능을 나타낼 것으로 추정된다. 본 연구는 맥류의 잎집눈무늬병균인 C. cereale의 생물학적 방제제로서의 Streptomyces sp. C2-4가 유망한 잠재적 후보 균주임을 검증하였다. 따라서 Streptomyces sp. C2-4의 실용화를 위해서는 항균 기작 규명이 우선적으로 이루어져야 하며, 또한 현장에서의 방제 효과 등을 검증하여 생물 농약으로 활용 가능한지에 대한 추가 연구가 필요할 것이다.

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