Agrobacterium rhizogenes에 의한 산딸기 뿌리혹병의 국내 첫 보고
First Report of Crown Gall Caused by Agrobacterium rhizogenes on Korean Raspberry (Rubus crataegifolius) in Korea
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Abstract
2022년 7월 부산광역시 기장군 산딸기 재배지에서 뿌리혹병의 발생이 확인되었다. 혹의 모양은 유백색 또는 흑갈색의 불규칙한 구조였다. 산딸기의 혹에서 분리된 세균은 yeast mannitol agar에서 점액성이 있는 흰색의 둥근 콜로니를 생성하였다. 분리균은 그람 음성이면서 다수의 편모를 가진 짧은 막대 모양이었다. 혹병균은 Agrobacterium rhizogenes와 생리·생화학적 특성이 일치하였으며, 계통학적으로 A. rhizogenes와 같은 그룹으로 분류되었다. 건전한 산딸기의 유모에 분리균을 접종하여 세균의 병원성을 확인하였다. 최종적으로 산딸기에서 발생한 뿌리혹병의 병원균은 A. rhizogenes로 동정되었다. 본 연구는 국내 산딸기에서 A. rhizogenes에 의한 뿌리혹병의 최초 보고이다.
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In July 2022, the occurrence of crown gall was observed on Korean raspberry (Rubus crataegifolius) plants in a field in Gijang-gun, Busan, Korea. The galls appeared irregular in structure and varied in color from milky white to dark brown. The isolate formed round, mucoid, white colonies on yeast mannitol agar. The bacteria were gram-negative and appeared as short rods with multiple flagella. The physiological and biochemical characteristics of the isolate were consistent with those of Agrobacterium rhizogenes, and phylogenetic analysis classified the strain into the same group as A. rhizogenes. We confirmed the pathogenicity of the isolate by inoculating it into healthy Korean raspberry plants. Consequently, the causal agent of crown gall disease in the Korean raspberry was identified as A. rhizogenes. This study is the first to report crown gall disease caused by A. rhizogenes in Korean raspberry in Korea.
장미과에 속하는 산딸기 (Rubus crataegifolius Bunge.)는 다년생 목본 식물로서, 고유한 풍미와 높은 영양 성분을 갖춰 전 세계적으로 재배되고 있다. 국내에서도 전국의 산과 들에서 흔하게 자라는 낙엽 떨기나무로 열매를 식용 또는 약용하기 위한 목적으로 일부 지역에서 재배하고 있다. 최근에는 항산화와 면역 활성 등 생리활성에 효과가 있는 것으로 보고되며 점차 재배면적이 증가하고 있다(Ni 등, 2009). 세계적으로 산딸기에는 Dydimella applanata와 Leptosphaeria coniothyrium에 의한 가지마름병(Mikulic‐ Petkovsek 등, 2014)과 Erwinia amylovora에 의한 화상병(Braun과 Hildebrand, 2006) 등이 보고되었다. 뿌리혹병의 경우 Agrobacterium tumefaciens에 의한 세균병이 보고된 바 있다(Dolan 등, 2018; Pulawska, 2010). 국내에서는 Colletotricum aenigma에 의한 점무늬병(Han 등, 2024)과 Botrytis cinerea에 의한 잿빛곰팡이병(Kim 등, 2017) 등 6종의 진균병이 보고되었지만, 세균병에 관한 보고는 없다(The Korean Society of Plant Pathology, 2024).
2022년 7월 부산광역시 기장군에 있는 농가의 산딸기에서 뿌리혹병의 발생이 확인되었다(Fig. 1A). 뿌리와 줄기의 밑 부분에서 비정상적으로 성장한 혹이 발생하였다. 발병 초기에는 부드럽고 작은 크기의 혹이 나타났으며, 시간이 지나면서 혹의 크기가 커지고 단단해지며 어두운색으로 변한 증상을 확인하였다. 병징에서 분리된 세균을 건전한 산딸기의 지제부에 접종하여 병원성을 검정하였다. 또한, 병원세균의 균학적 특성과 유전 정보를 분석한 결과, 분리균은 Agrobacterium rhizogenes로 동정되었다.
Symptoms of crown gall on the roots of Korean raspberry crops in a field in Gijang-gun, Busan (A). Pathogenicity of the inocu-late (YKB15607) in the roots of healthy raspberry plants (B). Colony type of the isolated strain on yeast mannitol agar (YMA) media (C). Morphological characteristics of the isolate at 16,000× magnification (D).
뿌리혹병의 병징이 관찰된 혹을 채집한 후, 병징 부위와 그 경계를 포함한 부분을 0.5×0.5 mm 크기로 잘라내고 70% 에탄올을 사용하여 표면을 살균하였다. 이후 표면살균된 조직을 멸균수 700 µl와 함께 물리적으로 균질화하였다. 30분간 실온에서 정치한 시료를 yeast mannitol agar (YMA; yeast extract 1 g, mannitol 10 g, KH2 PO4 0.5 g, MgSO4·7H20 0.2 g, NaCl 0.1 g, CaCO3 1 g, agar 15 g/l, pH 6.8) 배지에 획선배양하여 28 o C 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세균 중 대표적인 콜로니를 선택하여 YMA 배지에서 동일한 조건으로 4회 배양 후, 단일 콜로니를 분리하였다. 순수 분리된 3개 균주는 10% 글리세롤 용액에 혼합하여 –80 o C에서 동결 보존하여 후속 실험에 사용하였다. 산딸기 뿌리혹에서 분리된 대표세균(YKB15607)의 병원성을 검정하기 위해 YMA 배지에서 배양된 세균을 멸균 증류수에 현탁(1.0×106 cfu/ml)한 뒤, 주사기를 사용하여 건전한 식물체의 뿌리에 10 µl 인공적으로 접종하였다. 같은 방법으로 대조군에는 멸균수를 접종하였다. 25-28 o C의 온도와 70%의 습도로 조절된 온실에서 43일 생육 후, 인공접종한 부위에서 세균들은 전형적인 혹을 생성하였으며(Fig. 1B), 혹 부위에서 세균을 재분리하여 처음 접종한 균주와 동일한 세균의 유무를 확인하였다.
산딸기에서 분리된 세균은 YMA 배지에서 점액성이 있는 흰색의 둥근 콜로니를 생성하였다(Fig. 1C). 28 o C에서 16시간 동안 배양한 세균을 투과전자현미경(transmission electron microscopy, LEO 912 AB; ZEISS, Oberkochen, Germany)을 통해 16,000배로 형태를 관찰한 결과, 다수의 편모를 가진 짧은 막대 모양이었다(Fig. 1D). 그람 반응은 음성이었으며, 분리 세균을 nutrient glucose agar (beef extract 3 g, peptone 5 g, glucose 2.5 g, agar 15 g/l) 배지에 24시간 배양하여 oxidase 활성 검사용 시약(bioMérieux, Marcy-I’Étoile, France)에 처리한 뒤 자주색 반응 여부를 파악한 결과, oxidase 반응이 음성으로 조사되었다. 35 o C의 온도 조건과 2% NaCl이 첨가된 배지에서 48시간 동안 배양하였을 때, 분리균은 생장하지 않았다. 3-ketolactose의 생성 여부를 확인하기 위해 lactose가 첨가된 배지(yeast extract 1 g, lactose 10 g, agar 20 g/l)에서 48시간 배양한 후 베네딕트 시약의 반응을 관찰하였다(Schaad, 1981). 분리균의 콜로니 주변에서 노란색의 영역이 나타나지 않아 3-ketolactose을 생성하지 않는 것으로 확인되었다. 0.5%의 CaCO3가 첨가된 감자 한천 배지(potato dextrose agar)에서 콜로니 주변에 투명한 영역을 형성하여 산을 생성하는 것이 확인되었다. Ferric ammonium citrate가 첨가된 배지에서 sidero-phore 생성 반응이 음성이었지만, citrate 이용 반응은 양성이었다. Erythritol과 tartrate가 첨가된 배지에서는 산이 생성되었으나, sucrose와 melezitose가 첨가된 배지에서는 산이 생성되지 않았다. 또한, Agrobacterium 속의 동정에 사용되는 2가지의 영역에 대해 polymerase chain reaction (PCR) 반응을 확인하였다. UF (universal forward for chromosomal 23S rRNA gene)와 A. rhizogenes (biovar2)에 특이적으로 증폭하는 B2R 프라이머(5′-TCCGATACCTCCAGGGCCCCTCACA-3′)를 사용하였으며, CYT {5′-GATCG(G/C)GTCCAATG(C/T)TGT-3′}, CYT′{5′-GATATCCATCGATC(T/C)CCT-3′} 프라이머를 사용하여 Ti plasmid ipt gene 영역을 증폭하였다. UF/B2R 프라이머의 PCR 반응 조건은 Haas 등(1995)을 참고하였으며, CYT/CYT'의 경우 Puławska 등(2006)의 방법을 사용하였다. 증폭된 PCR 산물은 1.5% agarose gel에서 1 kb DNA ladder (DYNEBIO, Seong-nam, Korea)와 나란히 전기영동을 한 후, ultra violet (UV)을 통해 증폭 여부를 확인하였다. 결과로, 분리균(YKB15607)은 UF/B2R를 통해 1,066 bp, CYT/CYT'에서 427 bp의 PCR 증폭이 확인되었다(Table 1). 본 연구에서 분리된 산딸기 뿌리혹병균은 Kuzmanović 등(2013)이 보고한 A. rhizogenes와 배양적, 생리·생화학적 특성이 일치하였고, Iličić 등(2024)이 Agrobacterium 속의 동정에 사용한 2가지의 영역을 증폭한 PCR 반응 결과도 A. rhizogenes와 같은 것으로 확인되었다. 분리균은 35 o C와 2% NaCl에서 생장하지 않는 것에서 A. tumefaciens와 구분된 특성을 가졌고, sucrose와 melezitose에서 산을 생성하지 않는 특성과 tartrate가 첨가된 배지에서는 산을 생성하는 것으로 A. rhizogenes와 일치한 특성을 확인하였다. 결과적으로, 산딸기의 혹에서 분리된 세균은 A. rhizogenes와 동일한 균학적 특성을 가진 것으로 조사되었다.
Bacteriological characteristics of the isolated strain com-pared to closely related Agrobacterium species
16S rRNA 영역과 항존유전자 (dnaK, glnA)의 염기서열 분석은 마크로젠(MACROGEN, Daejeon, Korea)에 의뢰하였다. dnaK 영역의 염기서열 분석에 사용된 프라이머는 dnaKF (5′-GAAGACTTCGACATGCGTCT-3′)와 dnaKR (5′-GCCGAG-CAGCTTGTTGTC-3′)이며, glnA 영역의 유전 정보 분석에는 glnAF (5′-GTCATGTTCGACGGCTCCT-3′)와 glnAR (5′-CCTTG-GCATGCTTGATGAT-3′)을 사용하였다. 분석된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) GenBank 에 등록된 염기서열 정보와 BLAST를 통해 Agrobacterium 속과의 상동성을 확인하였고, MEGA11 프로그램을 사용하여 maximum likelihood 알고리즘을 통해 계통수를 작성하였다(Tamura 등, 2021). 분석에 사용된 식물병원성의 Agrobacterium 속과 Rhizobium 속 균주는 NCBI database에 등록된 유전자 정보를 사용하였다(Table 2). 1,000회 반복의 bootstrap 을 수행하여 통계적 유의성을 확인하였으며, 16S rRNA 영역과 항존유전자 (dnaK, glnA) 영역의 계통도를 작성하였다. 산딸기 분리균(YKB15607)은 16S rRNA의 염기서열(GenBank accession No. PV168529)이 Agrobacterium rhizogenes ATCC11325와 99.79%의 일치율을 나타냈다. 결과로, 계통도에서 A. rhizogenes와 같은 그룹(clade)을 형성하며 다른 근연종과 구분된 그룹임을 확인할 수 있었다(Fig. 2). 최종적으로, 균학적 특성과 유전 정보의 분석 결과를 종합하여 보았을 때, 산딸기 뿌리혹에서 분리된 YKB15607은 A. rhizogenes로 동정되었다. Agrobacterium rhizogenes YKB15607 균주는 농업미생물은행(Korean Agricultural Culture Collection)에 기탁(KACC24031)되었다. 본 연구의 결과는 국내 산딸기 재배 농가의 생산성 향상에 기여할 수 있는 기초 자료를 제공할 것이며, 추후 산딸기 뿌리혹병의 생태와 방제에 관한 추가적인 연구가 지속되어야 할 것이다.
Type strain sequences of Agrobacterium spp. considered in this study from the NCBI database
Maximum-likelihood phylogenetic tree illustrating the relationship between isolate YKB15607 and plant-pathogenic Agrobacterium species based on 16S rRNA (A) and the combined sequence of housekeeping genes (dnaK, glnA) sequence data (B). All nucleotide sequences of Agrobacterium spp. were retrieved from GenBank. Phylogenetic trees were generated with 1,000 bootstrap replicates for statistical support.
Notes
Conflicts of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Acknowledgments
This work was supported by the National Institute of Agricultural Sciences grant (PJ016734) from the Rural Development Administration, Republic of Korea.