농업유전자원센터 미생물은행 (Korean Agricultural Culture Collection, KACC)에서 분양받은 M. fructicola NO.44711 1 균주, 국립원예특작과학원(National Institute of Horticultural & Herbal Science)에서 32균주(2023년 상반기) 그리고 글로벌농업컨설팅㈜에서 국내 시/군 단위인 35개 지역에서 분리한 112균주(2023년 하반기 58개, 2024년 상반기 54개)로 KACC에서 분양받은 비교 균주(reference strain) 포함 145개 핵과류 잿빛무늬병균 (Monilinia spp.)을 분양받아 사용하였다(Table 1). 분양받은 병원균들은 모두 식물체 과실의 병반에서 포자를 채집 후 단포자 분리를 통해 분리되었다. 잿빛무늬병균 배양 방법은 선행 연구 결과에 따르면 Monilinia spp.가 포자와 균사 생장이 빠르다고 알려진 V8 배지(CaCO₃ 2 g; V8 juice 200 ml; agar 20 g; distilled water 800 ml per 1 liter)로 선정하였으며 25 ^o C 정체배양기에서 암 조건으로 배양하였다(Vasić 등, 2018).

국립원예특작과학원, 글로벌농업컨설팅㈜ 및 농업유전자원센터 미생물은행에서 분양받은 145개 균주를 정확한 동정을 하기 위해 형태학적 동정과 분자생물학적 방법을 진행하였다. 병원균의 포자 및 균사 생장을 확인하기 위해 potato dextrose agar 배지(potato starch 4 g, dextrose 20 g, agar 20 g, distilled water per liter)를 제작하여 배양하였으며, 유전자 동정을 위해서는 포자와 균사 생장이 빠른 V8 배지(CaCO₃ 2 g; V8 juice 200 ml; agar 20 g; distilled water 800 ml per liter)를 제작하였다. 배지에 병원균을 치상 후 25 ^o C 정체배양기에서 암 조건으로 5일간 배양하였다.

병원균의 균학적 특성 확인 및 형태학적 동정을 수집한 포자를 Olympus BX53 optical microscope (Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 사용하여 200×, 400× 배율로 포자 및 균사를 관찰하였다. 다음 분자생물학적 동정을 위해 DNA 추출을 진행하였다. CTAB (2% cetyltrimethylammonium bromide, 1% polyvinylpyrrolidone, 100 mM Tris-HCl, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA pH 8.0) 500 μ l가 들어있는 1.7 ml E-tube에 V8 배지에 5일 이상 배양하여 형성된 포자와 균사를 채취하여 첨가하였다. Proteinase K solution (20 mg/ml) 8 μ l를 첨가 후 65 ^o C 에 10분 간격으로 tissue grinder로 총 3회 분쇄하였다. 분쇄 후 PCI (phenol:chloroform:isoamyl alcohol, 25:24:1) 500 μ l 투여하고 10회 inverting 후 원심분리기를 통해 12,300 × g으로 10분간 진행하여 DNA를 분리하였다. 상층액을 새로운 E-tube에 넣고 400 μ l Isopropanol을 첨가하여 원심분리기를 이용하여 12,300 × g으로 5분간 원심분리를 진행하였다. 원심분리 완료 후 상층액을 제거한 E-tube에 70% ethanol 500 μ l를 넣고 10회 inverting하였다. 마지막 12,300 × g으로 5분간 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하였다. E-tube에 남아있는 ethanol을 완전히 제거하기 위해 상온에서 2시간 이상 건조하였다. 건조가 끝난 E-tube에 TE buffer 20 μ l 첨가하여 DNA 추출을 완료하였다(Fatima 등, 2011; Kim 등, 2016). 추출한 DNA 순도를 확인하기 위해 NanoDrop 2000C spectrophotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하여 purity (260/280 ratio 1.8-2.0, 260/230 ratio 1.8-2.2)와 quantity 확인을 하였다(Desjardins와 Conklin, 2010).

분자생물학적 동정은 ITS (580 bp), lcc2 (763 bp), β-tubulin (1164 bp), cyt B (1176 bp), TEF1-α (250 bp) 총 5가지 영역으로 염기서열을 이용하였다(Hily 등, 2011; Hu 등, 2011; White 등, 1990; Zhu 등, 2016) (Table 2). Primer는 ITS1 (5’-GCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’)/ITS4 (5’-GCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’), LacaF (5’-GCA TCT GCA TCT GCT ATT CCA GCT-3’)/LacaR (5’-CTT ACC GCC ACC AAC GCA GTT-3’), Mon-TubF1 (5’-ATG CGT GAG ATT GTA CGT AT-3’)/Mon-TubR1 (5’-GTA CCA ATG CAA GAA AGC CT-3’), Colaexon3-fwd (5’-TTT ACC TTA CGG TCA AAT GAG CCT-3’)/Colaexon4-rev (5’- AAC TCA ACA ATA TCA CCT CCA ATT CAT-3’), EF1-α F (5’-CAT CGA GAA GTT CGA GAA GG-3’)/EF1-α R (5’-TAC TTG AAG GAA CCC TTA CC-3’)을 사용하였다(Table 2). PCR 혼합물에는 바이오니아사(BIONEER Inc., Daejeon, Korea)의 dNTP, Toq polymerase, 10X reaction buffer를 사용하였다. PCR-tube (0.2 ml)에 DNA 100 ng, dNTP 1 μ l, Taq polymerase 0.5 μ l, 10X reaction buffer 2 μl를 넣고 각 영역에 맞는 primer forward 1 μ l, reverse1 μl를 넣고 최종적으로 total volume 20 μ l가 되도록 distilled water를 첨가하였다. 각 증폭 영역에 따라 T100 thermal cycler (Bio-Rad Laboratories Inc., Waltham, CA, USA), Techne TC-512 thermal cycler (Keison Products Inc., Essex, CA, USA)를 사용하여 ITS (95 ^o C 6 min, 94 ^o C 30 sec, 50 ^o C 30 sec, 72 ^o C 1 min, 72 ^o C 10 min, 30 cycle), lcc2 (94 ^o C 3 min, 94 ^o C 30 sec, 52 ^o C 30 sec, 72 ^o C 1 min 30 sec, 72 ^o C 10 min, 35 cycle), β-tubulin (95 ^o C 3 min, 95 ^o C 30 sec, 52 ^o C 30 sec, 72 ^o C 1 min, 72 ^o C 3 min, 35 cycle), TEF1-α (94 ^o C 2 min, 94 ^o C 30 sec, 52 ^o C 1 min, 72 ^o C 1 min, 72 ^o C 3 min, 35 cycle), cyt B (94 ^o C 2 min, 94 ^o C 30 sec, 55 ^o C 30 sec, 68 ^o C 2 min 30 sec, 68 ^o C 4 min, 30 cycle) PCR을 진행하였다. PCR을 진행한 후 원하는 유전자가 증폭이 됐는지 확인을 위해 전기영동을 실시하였다. PCR 산물 20 μ l에 10× loading buffer (TAKARA Bio Inc., Shiga, Japan) 2 μ l 첨가 후 pipetting하여 1.5% agarose gel (TE buffer 100 ml, 1.5 g agerose)에 넣고 1 Kb DNA Ladder RTU (GeneDireX, Inc., Hsinchu, Taiwan) 3 μ l를 사용하였으며 Mupid-exU (Advanced Biotechnologies, Inc., Eldersburg, MD, USA) 100 V로 20분간 진행 후 원하는 유전자의 증폭을 확인하기 위해 최종적으로 UV로 확인하였다. 원하는 절편 외 다른 불순물을 제거하기 위하여 Expin ^TM Combo GP Kit (GeneAll Biotechnology Co., Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 정제 후 코스모진텍(Cosmogentech Inc., Seoul, korea)에 염기서열 분석을 수행하였다.

분석이 완료된 염기서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에서 동정하였다. NCBI에 등록된 참조 균주들의 5가지 영역에 대한 FASTA 파일을 확보한 후 MEGA 11 software (version 11.0.13)를 사용해 유사성 확인을 진행하였다. 이후 R 프로그램(R version 4.3.3)을 사용하여 multiple sequence alignment 진행 후 multilocus 를 위해 MEGA 11 software를 사용하여 다중 유전자 염기서열 계통수를 생성하여 정확한 계통학적 분석을 하였다(Tamura 등, 2021).

핵과류에 식물병리학적으로 중요한 잿빛무늬병을 일으키 는 주요 종은 Monilnia spp.로 알려져 있으며 그중 M. fructicola 와 M. laxa가 핵과류 병원균 중 공격적인 Monilinia 종으로 알려져 있다(De Miccolis Angelini 등, 2022). 유럽에서는 M. laxa가 주로 발견되고, M. fructicola는 호주와 미국에서 주로 발견되었다. 그러나 국내는 전라도의 전주와 임실 두 지역에서 2년간 핵과류에서 발생한 잿빛무늬병에 대한 조사만 이뤄졌을 뿐 현재 전국적 단위로 Monilinia spp.의 분포에 대한 기초 자료가 부족한 실정이다(Oh 등, 2017). 본 연구에서는 강원, 경기, 경상, 전라, 충정 총 5개의 권역에서 2023년, 2024년 2년간 잿빛무늬병이 발생하는 핵과류 과실 재배지에서 분리된 144개 균주를 사용하였다(Table 1). 병원균을 동정하기 위해 형태학적 동정과 계통학적 동정을 위해 ITS, lcc2, β-tubulin, cyt B, TEF1-α 5가지 영역 중에서 4가지 유전자를 사용하여 동정하였다(Fig. 1). 2023년도 상반기(first half of 2023)에 분리된 그룹(32 isolates)을 ITS, β-tubulin, cyt B, TEF1-α 4가지 영역을 이용하여 다중 유전자 염기서열 분석(multilocus sequence) 결과 2023년 상반기에 분리된 32개 균주 모두 Monilinia 속과 99% 이상의 유전적 유연관계를 보였으며, M. fructicola로 분류되었다(Fig. 1A). 2023 하반기에 분리된 58개 균주도 상반기 32개의 균주와 동일하게 진행하고자 하였으나 TEF1-α 유전자를 PCR 증폭 과정에 단일 증폭에 어려움이 있어 lcc2 유전자로 변경 후 ITS, lcc2, β-tubulin, cyt B 4가지 영역을 이용하여 다중 유전자 염기서열 분석을 진행하였다. 그 결과 M. fructicola와 99% 이상의 유전적 유연관계로 식별되어 M. fructicola로 동정하였다(Fig. 1B). 추가적으로 비교 균주(reference strain)로 KACC에서 분양받은 NO. 44711 균주 또한 4가지 유전 영역을 동정하였을 때 M. fructicola로 분류되는 것을 확인하였다. 그러나 2023년에서는 모든 90개의 병원균이 M. fructicola로 식별된 반면에 2024년에 분리된 54개 병원균 중 52개 균주는 4가지 영역을 이용한 다중 유전자 염기서열 분석에서 M. fructicola로 분류되었고, G62와 G73인 2개의 균주는 ITS와 lcc2 2가지 영역에서 M. laxa로 식별되었다(Fig. 1C-E).

KACC에서 분양받은 M. fructicola와 M. laxa로 확인되는 2개의 균주(G62, G73)를 25 ^o C의 동일한 조건에서 배양하였을 시 M. laxa로 동정된 균주가 상대적으로 균사 생장이 느리고 포자를 잘 형성되지 않는 것을 확인하였다(Fig. 2). 이것은 M. fructicola보다 M. laxa가 25 ^o C에서 생육 속도가 상대적으로 느리다는 선행 연구와 동일한 결과를 보여주는 것을 확인할 수 있었다(Hu 등, 2011; Martini와 Mari, 2014). 배양된 균총의 색상은 M. laxa, M. fructicola 두 종 모두 회색을 가지는 것을 확인하여 선행 결과와 동일하다는 것을 알 수 있다(Fig. 2). 광학 현미경을 이용하여 포자를 관찰한 결과, M. fructicola, M. laxa 두 종 모두 균사에서 Monilinia spp.의 특징으로 알려진 monilioid chain을 형성하고 약 9-11 μ m 크기의 타원 형태 분생포자를 생성하는 것을 확인하여 선행 연구에서 조사된 Monilinia spp. 포자 크기와 유사한 것을 확인하였다(Hu 등, 2011) (Table 3). 이러한 결과는 형태학적 특성만으로 2종의 Monilinia를 특정하기 어려운 것을 시사한다. 따라서 Monilinia spp.의 정확한 분류 동정을 위하여서는 필수적으로 분자생물학적 동정을 수행하여야 할 것으로 사료된다.

한국식물병 명목록에 따르면 현재까지 국내에서 핵과류인 매실, 체리, 복숭아, 자두 등에서 잿빛무늬병을 초래하는 종은 Monilinia fructicola, M. laxa와 M. kusanoi로 3종이 알려져 있다(The Korean Society of Plant Pathology, 2022). 그러나 본 연구에서는 M. fructicola뿐 아니라 M. laxa도 발견할 수 있었으나 그 외의 종은 확인되지 않았다(Table 1, Fig. 1). 이는 국내에서 2015년, 2017년 각 2년 동안 3곳의 포장지에서 발생한 brown rot를 조사한 선행 연구와 2022년에 39개의 brown rot 병원균을 동정한 선행 연구에서 모두 M. fructicola로 동정된 결과와 유사하였다(Lee 등, 2024; Oh 등, 2017). 즉 선행 연구와 본 연구 결과를 통해 국내에서 핵과류 잿빛무늬병을 발병시키는 병원균은 M. fructicola가 우점하고 있는 것으로 확인되었다. 또 다른 선행 연구에 따르면 Monilinia spp. 중에서 M. fructicola가 다양한 살균제 계열에 대한 저항성 보고가 많이 되어 있으며 M. laxa 보다 살균제 저항성을 쉽게 가질 수 있는 것으로 알려져 있다(Papavasileiou 등, 2015; Rungjindamai 등, 2014; Villarino 등, 2013). 그러므로 국내에 분포하고 있는 핵과류 잿빛무늬병균을 동정하여 M. fructicola가 우점하고 있는 것을 확인하였으므로 저항성 출현 가능성이 높은 M. fructicola 살균제 저항성에 관한 연구가 필요하다는 것을 시사한다.

선행 연구에 따르면 M. laxa는 5 ^o C에서 포자 형성이 뛰어나지만 22 ^o C 이상일 경우 포자가 잘 형성되지 않는 특징이 보고되었다. 반면 M. fructicola는 포자 형성을 빠르게 하는 것을 확인하였다(Bernat 등, 2017; Martini와 Mari, 2014). 본 연구에서 형태학적 동정을 위해 동일한 배지에서 일정 기간 배양하였을 시 M. fructicola가 M. laxa보다 빠르게 균사 생장 및 포자 형성하였으며, 이는 지구 열대화로 점차 고온이 되어 가는 국내에서 M. fructicola가 우점하는 것이 가속화될 것으로 사료된다. 또한 M. yunnanensis와 M. mumecola 두 종은 한반도와 가까운 일본과 중국에서 발견되었으며 선행 연구에 따르면 M. fructiola와 유사한 균학적 특성과 유사한 생육 온도를 가진 것으로 알려져 있다(Harada 등, 2004; Yin 등, 2015). 이로 인해 이번 연구에서는 2종 (M. fructicola, M. laxa) 만이 발견되었으나, 추후에는 기후 변화와 해외 유입과 같은 외부 요인에 의해 전국적으로 발병되는 Monilinia 종의 변화가 다양화될 가능성도 있어 연도별로 다양한 핵과류 잿빛무늬병균의 분포 양상에 관한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.