사과겹무늬썩음병균의 다유전자 계통 분석.

본 연구에서는 2005년에서 2022년까지 경상도, 충청도, 전라도, 경기도 및 강원도 소재 사과원에서 분리된 Botryosphaeria spp.를 확보하여 실험을 수행하였다(Supplementary Table 1). 사과 과실 및 줄기에서 분리된 238개의 Botryosphaeria spp. 균주 중, 41개 균주는 국립원예특작과학원에서 분양받았고, 98개 균주는 글로벌농업컨설팅에서 제공받았으며, 나머지 99개 균주는 경북대학교 식물균병학연구실에서 보유한 균주를 사용하여 실험을 수행하였다(Table 1). 이후 확보된 균주의 분자생물학적 동정은 HiGene Genomic DNA prep kit (Bio-fact, Daejeon, Korea)를 이용하여 total genomic DNA를 추출 후, internal transcribed spacer (ITS) region, translation elongation factor 1-α (tef1), β-tubulin (tub2) gene을 각각 ITS1F (5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)/ITS4 (5’-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3’), EF1-688F (5’-CGGTCACTTGATCTA-CAAGTGC-3’)/EF1-1251R (5’-CCTCGAACTCACCAGTACCG-3’), Bt2a (5’-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3’)/Bt2b (5’- ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’) 프라이머를 사용하여 증폭하였다(Alves 등, 2008; Gardes와 Bruns, 1993; Glass와 Donaldson, 1995; White 등, 1990). 증폭된 산물은 ExoSAP-IT^TM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, OSA)를 이용하여 정제하였으며, Bioneer (Daejeon, Korea)를 통해 염기서열을 분석하였다. 확보한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI) BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)를 통해 이전에 보고된 염기서열과 비교한 뒤, 분리한 균주들과 근연종들 간의 계통학적 유연관계 비교를 위해 MEGA X 프로그램에서 neighbor joining 방법을 사용하여 계통수를 작성하였다(Kumar 등, 2018).

Table 1.

List of isolates used in this study

한천희석법에 의한 살균제별 균사 생장 억제 효과 검정.

한천희석법을 이용하여 확보된 균주들의 benomyl WP (active ingredient [a.i.], 50%; FarmHannong, Seoul, Korea)와 tebuconazole WP (a.i., 25%; Bayer Crop Science, Seoul, Korea)에 대한 균사 생장 억제 효과를 조사하였다. 사용한 각 살균제의 유효성분 함량을 고려하여, potato dextrose agar (Difco, Detroit, MI, USA)에 benomyl은 0.01, 0.1, 1, 10, 100 μ g/ml, tebuconazole은 0.016, 0.08, 0.4, 2, 10 μ g/ml가 최종 농도가 되도록 살균제 희석 배지를 제작하였다. 접종원인 Botryosphaeria spp.는 25^°C의 암 조건에서 7일간 배양한 뒤, 균총 선단에서 직경 4 mm의 균사조각을 cork borer로 떼어내어 접종원으로 사용하였다. 접종 후 6일간 배양하여 균총의 직경을 조사하고, PDA 배지에서 배양한 균의 직경과 비교하여 확인된 균사 생장 억제 효과는 다음 식을 통해 계산하였다: 균사 생장 억제 효과(%) = [1 - (살균제 첨가 배지의 균총 직경 / 살균제 무첨가 배지의 균총 직경)] × 100.

EC₅₀ (half maximal effective concentration) 값의 경우, GraphPad Prism^® software (version 10.2.3; Dotmatics, La Jolla, CA, USA)의 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 통해 산출하여 각 균주의 감수성 정도를 확인하였다(Pugliese 등, 2018). 산출한 결과를 통해 EC₅₀ 값으로 순위를 정하고, 상대적으로 EC₅₀ 값이 높았던 15개 균주와 낮았던 15개 균주를 선발하여 각각 약제 감수성이 낮은 집단과 높은 집단으로 구분하였다. 또한, 실험에 사용한 병원균을 다양한 기준에 따라 집단을 나누어 감수성 정도를 비교하기 위해 병원균 종, 분리 지역, 분리 연도에 따라 EC₅₀ 값의 평균값, 중앙값, 분포를 비교하였다. EC₅₀ 값의 분포는 각 집단의 균주 개수에 차이가 있는 것을 감안하여 구간별 분포 비율(%)로 계산하여 비교하였다.

β-tubulin 유전자 증폭 및 염기서열 분석.

Benomyl에 대하여 낮은 감수성을 나타낸 균주와 높은 감수성을 나타낸 균주를 대상으로 β-tubulin 유전자의 점돌연변이를 검정하였다. 167번, 198번, 200번째 codon의 변이 여부를 확인하기 위해, 이전 연구에 기술된 Tub-C′ (5′-GAGGAATTCCCAGACCGNATGATG-3′)/Tub-F (5′-GACGTTGTTGGGNATCCA-3′) 프라이머를 사용하여 β-tubulin 유전자를 증폭하였다(Albertini 등, 1999). Polymerase chain reaction 반응은 95^°C에서 5분간 predenaturation 수행 후, 95^°C에서 30초간 denaturation, 52^°C에서 30초간 annealing, 72^°C에서 1분간 extension을 35회 반복하였고, 72^°C에서 10분 동안 final-elongation 을 수행하였다. 이후 증폭된 산물에 대해 상기와 동일한 방법으로 정제 및 분석을 실시하였다. 분석된 유전자의 염기서열은 이전에 보고된 carbendazim 저항성 균주인 Botryosphaeria dothidea BD10 (accession number: MZ197999)과 감수성 균주인 B. dothidea BD26 (accession number: MZ197998)의 β-tubulin 유전자 염기서열과 비교하여 점돌연변이 여부를 확인하였다(Wang 등, 2022).

살균제 처리에 따른 과실에서의 겹무늬썩음병 억제 효과 검정.

Benomyl 및 tebuconazole에 대해 상대적으로 EC₅₀ 값이 높았던 3개 균주와 낮았던 3개 균주를 선발하여 사과 과실(cv. 피크닉)에 접종 후 살균제를 처리하여 병 억제 효과를 검정하였다. 먼저 과실 표면을 70% ethanol로 소독한 뒤 충분히 건조하여 습기를 제거하였고, 각 살균제를 권장 사용 농도(benomyl WP: 332.5 μ g/ml; tebuconazole WP: 250 µg/ml)로 희석하여 준비하였다. Cork borer를 이용하여 과실 표면에 직경 4 mm의 상처를 내고, 25^°C 배양기에서 7일간 배양한 사과겹무늬썩음병균의 균사디스크를 4 mm cork borer를 사용해 떼어내어 과실에 접종하였다. 이후 권장 사용 농도로 희석한 살균제에 30초간 침지한 후 30분간 건조하였다. 처리된 과실은 70% ethanol로 소독한 플라스틱 용기(250×200×100 mm, L× W× H)에 넣어 25^°C 배양기의 암 조건에서 보관하였다. 무처리구의 경우 동일한 방법으로 표면 소독 후 균사를 접종한 뒤 살균제를 처리하지 않고 동일한 조건에서 보관하였다. 이 후 접종 7일차에 약제 처리구와 무처리구의 과실에 형성된 병반의 직경을 측정하였으며, 병 억제 효과는 다음 식을 이용하여 계산하였다: 병 억제 효과(%) = [1 - (살균제 처리 과실 병반 직경 / 살균제 무처리 과실의 병반 직경)] × 100.

Botryosphaeria 균주의 분자생물학적 동정.

전체 238개의 균주 중 204개 균주는 Botryosphaeria sinensis, 34개 균주는 B. kuwatsukai와 동일한 cluster를 형성하였다(Supplementary Fig. 1). 따라서, 국내 사과원에 우점하여 분포하고 있는 겹무늬썩음병균은 기존에 알려진 B. dothidea와 매우 근연한 B. sinensis로 확인되었으며(Lee 등, 2021), 최근 연구에서 보고된 B. kuwatsukai (Lim 등, 2023)도 약 14% 정도 분포하는 것으로 확인되었다.

국내 사과원에서 분리된 Botryosphaeria 균주의 살균제 감수성.

Benomyl에 대한 238개 Botryosphaeria 균주의 약제 감수성을 조사한 결과 대부분 유사한 억제 경향성이 확인되었다(Fig. 1A,C). 평균 EC₅₀ 값은 0.62 μ g/ml로 나타났으며, 가장 낮은 약제 감수성을 나타낸 균주의 EC₅₀ 값은 3.04 μ g/ml였다(Table 2). 전체 균주의 약 84%인 201개 균주의 EC₅₀ 값이 1.05 μ g/ml 이하에 분포하였다(Fig. 2A). Tebuconazole에 대한 약제 감수성을 조사한 결과 역시 모든 균주에서 유사한 억제 경향성을 확인하였다(Fig. 1B,D). 평균 EC₅₀ 값은 0.58 μ g/ml로 나타났으며, 가장 낮은 약제 감수성을 나타낸 균주의 EC₅₀ 값은 1.94 μ g/ml 였다(Table 2). 전체 균주의 약 90%인 215개 균주의 EC₅₀ 값이 0.90 μ g/ml 이하에 분포하였다(Fig. 2B). Botryosphaeria 종별로 분석하였을 때, 우점종인 B. sinensis 집단은 두 가지 약제에 대하여 모두 전체 집단과 유사한 경향을 나타냈다(Fig. 3A,B). 한편, B. kuwatsukai 집단에서는 benomyl과 tebuconazole에 대한 평균 EC₅₀ 값이 각각 0.32와 0.49 μ g/ml로 나타나 전체 집단에 비해 두 약제에 대한 감수성이 더 높았다(Fig. 3A,B). 지역별(경북 80개, 전북 48개, 강원 35개, 충북 35개, 경기 20개, 경남 11개, 충남 5개, 전남 4개) 분리 균주의 benomyl과 tebuconazole에 대한 감수성을 상자수염그래프(box and whisker plot)로 비교한 결과, 평균 EC₅₀ 값, 중앙값, EC₅₀ 값의 분포 범위에서 통계적으로 유의미한 수준의 차이는 확인할 수 없었다(Fig. 3C,D). 경시적인 약제 감수성 변화를 확인하기 위해, 2005-2020년에 분리한 75개 균주 집단과 비교적 최근인 2021-2022년에 분리한 163개 균주 집단으로 나누어 비교하였다. Benomyl에 대한 2005-2020년 집단의 평균 EC₅₀ 값은 0.70 μ g/ml로 나타난 반면 2021-2022년 집단의 EC₅₀ 값은 0.59 μ g/ml로 약제에 대한 감수성이 다소 증가한 것으로 나타났다(Fig. 3E). Tebuconazole의 경우 두 집단의 EC₅₀ 값은 각각 0.55 μ g/ml과 0.59 μ g/ml로 나타났으며 분포 그래프에서도 유의미한 차이를 나타내지 않았다(Fig. 3F). 결과적으로 국내 사과원에 분포하고 있는 Botryosphaeria 균주는 대부분 benomyl 및 tebuconazole 살균제에 감수성으로 확인되었으며, 본 실험에서 검정한 238개 균주 중 고도저항성을 획득한 균주는 확인되지 않았다.

Fig. 1.

Mycelial growth at each concentration of benomyl-amended (A) and tebuconazole-amended (B) potato dextrose agar media and the inhibition ratio (%) of 238 Botryosphaeria spp. in response to benomyl WP (A, C) and tebuconazole WP (B, D).

Table 2.

EC₅₀ values of Botryosphaeria isolates against benomyl and tebuconazole fungicides

Fig. 2.

Distribution of the EC₅₀ values for benomyl (A) and tebuconazole (B).

Fig. 3.

Distribution of EC₅₀ values of Botryosphaeria spp. populations by species (A, B), isolated regions (C, D), and isolated years (E, F). Middle line means median EC₅₀ values of all isolates of Botryosphaeria spp. which were assigned to Gyeongbuk (GB), Gyeongnam (GN), Chungbuk (CB), Chungnam (CN), Jeonbuk (JB), Jeonnam (JN), Gwangwon (GW), and Gyeonggi (GG). Black dots indicate strains with EC₅₀ values that were not assigned within the 2.5–97.5 percentile range for each region, and NS means not significant among regions (C, D). Benomyl (A, C, E). Tebuconazole (B, D, E).

다양한 병원균에서 각 집단별 균주 수에 관계없이 지역별, 종별 그리고 연도에 따른 감수성 차이를 보고하고 있다. 이전 연구에 따르면, benzimidazole계 살균제에 대한 감수성을 병원균 종에 따라 비교한 결과 Colletotrichum gloeosporioides s. lat.는 β-tubulin gene에서 점돌연변이(E198A)를 나타내며 질적 저항성을 보였다. 반면, C. acutatum s. lat.의 경우 이러한 변이 없이 모두 양적 저항성을 보여 감수성에 차이가 나타났다(Isa와 Kim, 2022). Macrophomina phaseolina를 제주도와 제주도 이외의 지역으로 구분하여 prochloraz 등 5종의 살균제에 대해 감수성을 비교한 연구에서는 제주도 이외의 지역에서 분리한 균주가 2.2배 이상의 EC₅₀ 값을 보여 감수성의 차이가 확인되었다(An 등, 2022). 분리한 연도에 따라 경시적인 변화를 관찰한 연구에서는 딸기, 토마토 등에서 분리한 Botrytis cinerea가 SDHI계 살균제에 대해 100 μ g/ml 이상의 EC₅₀ 값을 보이는 저항성 균이 2011년, 2015년 그리고 2016년으로 갈수록 증가하였다(Baek과 Kim, 2021). 하지만 본 연구에서 benomyl과 tebuconazole에 대해 238개 사과겹무늬썩음병균을 대상으로 산출한 EC₅₀ 값을 집단별로 비교한 결과, 평균 EC₅₀ 값과 구간별 균주 분포에서 이전 연구와 달리 확연한 차이를 나타내지 않았다.

β-tubulin 유전자 염기서열 및 변이 분석.

Benomyl에 대한 EC₅₀ 값이 가장 높고 낮았던 30개 균주에 대해 β-tubulin gene 을 분석한 결과, 두 집단 모두 감수성 균주인 Botryosphaeria dothidea BD26의 198번 codon과 동일한 GAG (glutamate)로 확인되었으며, 167번와 200번 codon 또한 TTC (phenylalanine)로 확인되어 점돌연변이를 확인할 수 없었다(Fig. 4). Benzimidazole계 살균제는 β-tubulin 유전자에서 점돌연변이를 보이며 저항성이 나타나는 기작이 대표적으로 알려져 있는데, 이 중 198번 codon이 GAG (glutamate)에서 GCG (alanine)로 치환되는 돌연변이(E198A)가 주요하게 보고되어 있다(Fungicide Resistance Action Committee, 2024). B. dothidea를 포함해 Monilinia fructicola, Colletotrichum gloeosporioides, Botrytis cinerea 등의 다양한 병원균에서 E198A 돌연변이에 의한 살균제 저항성이 보고되었다(Fan 등, 2022a; Weger 등, 2011; Yuan 등, 2022). 또한, Gibberella zeae에서는 F167Y, F200Y 점돌연변이에 의한 benzimidazole계 살균제 저항성이 보고된 바 있다(Qiu 등, 2011). 하지만 본 연구에서 검정한 30개 균주는 이러한 점돌연변이가 확인되지 않아 benomyl에 대해 질적 저항성을 보이지 않는 감수성 균주로 나타났다. 하지만 Phytophthora sojae에서 Q8L, C165Y, I258V 등 다양한 위치의 점돌연변이에 의한 저항성이 확인된 만큼(Peng 등, 2019), Botryosphaeria spp.에 대한 지속적인 모니터링과 함께 β-tubulin의 전체 시퀀스를 파악하여 저항성 균의 조사가 필수적이다. 추가적으로, 현재까지 Botryosphaeria spp.에 대해 DMI계 살균제에 저항성을 부여하는 유전자의 변이 위치가 정확히 특정되지 않아 본 연구에서 점돌연변이 검정을 실시하지 않았으나, 차후 이에 대한 검정 역시 실시해야 할 것으로 판단된다.

Fig. 4.

β-tubulin gene sequences of selected sensitive and less sensitive Botryosphaeria spp. in response to benomyl. Portions of the β-tubulin gene sequence in carbendazim sensitive and resistant Botryosphaeria spp. isolates are shown, with the pertinent point mutation being highlighted in red and wild type sequences were highlighted in blue.

Benomyl과 tebuconazole 처리에 따른 병 발생 억제 효과.

Benomyl에서 상대적으로 높은 EC₅₀ 값을 보인 균주의 처리구 병반면적은 5.3-8.7 mm로 나타났으며, 낮은 EC₅₀ 값을 보인 균주 또한 6.2-8.1 mm의 병반면적을 보였다. 6개 균주의 무처리구의 병반면적은 18.1-29.3 mm로 확인되어 선정한 균주는 모두 살균제가 효과적으로 병 발생을 억제한 것으로 확인되었다(Fig. 5A,B). Tebuconazole에 대해 높은 EC₅₀ 값을 보인 균주는 4.0-8.2 mm, 낮은 EC₅₀ 값을 보인 균주는 2.4-5.1 mm의 병반면적을 보였으며, 전체 무처리구의 병반면적은 15.0-34.4 mm로 나타나 감수성의 차이와 관계없이 모두 무처리구에 비해 병반이 억제되는 모습을 보였다(Fig. 5C,D). 따라서, benomyl과 tebuconazole에 대해 EC₅₀ 값에 차이를 보인 균주들은 모두 식물체 상에서 병 발생이 효과적으로 억제되었으며, 두 그룹 간의 차이 역시 확인되지 않았다.

Fig. 5.

Control efficacy of benomyl and tebuconazole against sensitive and less sensitive Botryosphaeria spp. on apple fruit (cv. picnic). Pictures of Botryosphaeria inoculated apple fruits in response to benomyl (A), and tebuconazole (C). Lesion diameters after benomyl treatment (B) and tebuconazole treatment (D).

Benzimidazole계와 DMI계 살균제 모두 다양한 곰팡이에서 이미 저항성 혹은 내성이 다수 보고되었다. Botrytis cinerea, Colletotrichum spp., Venturia nashicola 등의 곰팡이에서 carbendazim, tebuconazole, difenoconazole 살균제에 대한 저항성이 국내외에서 확인되었으며(Isa 등, 2021; Kim 등, 2023a; Kwon 등, 2010; Park 등, 2002), Botryosphaeria dothidea 역시 국외에서 thiophanate-methyl, carbendazim, tebuconazole 에 대한 저항성이 보고되었다(Fan 등, 2016, 2022b; Wang 등, 2022). 국내의 경우 benomyl에 대해 배지상에서 균사 생장량을 통해 B. dothidea의 저항성이 보고된 바 있으나(Lee와 Park, 1994), 이후 살균제에 대한 명확한 감수성 평가는 미흡한 상태이다. 본 연구를 통해 국내 사과원에서 확보된 Botryosphaeria spp.의 살균제에 대한 감수성 평가를 진행한 결과 모든 균주가 benomyl과 tebuconazole에 대해 유사한 EC₅₀ 값과 분포 그래프를 나타내었으며, 점돌연변이 확인, 과실 접종 결과 역시 높은 EC₅₀ 값을 보인 균주 집단과 낮은 EC₅₀ 값을 보인 균주 집단 간에 유의미한 차이를 확인할 수 없었다. 추가적으로, benzimidazole계에 속하는 thiophanate-methyl WP (70% a.i.; Kyung Nong, Gyeongju, Korea)와 DMI계에 속하는 met-conazole SC (20% a.i.; Dongbang Agro, Seoul, Korea)를 이용하여 benomyl과 tebuconazole에 대해 EC₅₀ 값에서 차이를 보인 20개 균주에 대해 동일한 시험을 수행하였다. 그 결과, 두 집단 간의 균사 생장 억제율이 대부분 유사한 것으로 나타났다(Supplementary Fig. 2). 따라서 benzimidazole계와 DMI계 살균제는 2005년부터 2022년까지 채집한 모든 B. sinensis와 B. kuwatsukai 균주들에 대해 높은 억제율을 보이는 것으로 판단된다. 하지만 기후 변화 등으로 인해 저항성 병원균이 발생할 가능성이 높아지고 있기 때문에(Lurwanu 등, 2021), 지속적인 저항성 모니터링과 함께 2020년 이전에 분리한 균주에 대한 추가적인 검정이 필수적일 것으로 판단된다. 또한 Botryosphaeria spp.는 기후 변화 등으로 인해 수체가 스트레스를 받을 때 발생 가능성이 높아진다고 알려져 있으므로(Sturrock 등, 2011), 살균제 제형이나 적절한 처리 방법 등을 고려하여 방제 방법을 수립해야 할 것이다. 위 결과는 차후 Botryosphaeria spp.에 의한 병해 방제를 위한 살균제 선발, 혹은 앞으로 나타날 수 있는 저항성 문제를 관리할 때 유용한 기초 자료가 될 것으로 기대된다.