양파 유전자원의 Stemphylium vesicarium에 의한 잎마름병 저항성 평가
Evaluation of Onion Germplasm for Resistance to Leaf Blight Caused by Stemphylium vesicarium
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Abstract
Stemphylium vesicarium에 의해 발병하는 양파 잎마름병은 전 세계적으로 발생하는 가장 중요한 곰팡이 병 중 하나로, 종자의 품질과 수확량을 감소시킨다. 본 연구는 잎마름병 저항성 양파 유전자원을 발굴하기 위하여, 110점의 양파 유전자원의 잎마름병에 대한 저항성을 조사하였다. 온실에서 재배한 4엽기 유묘의 잎을, 접종 직전에 탈지하지않은 비흡수성 재질의 솜으로 문지른 후에 멸균한 1/2 농도의 potato dextrose broth 용액으로 수확한 S. vesicarium KACC 44530 균주의 포자현탁액(1.0×105 spores/ml)을 분무하여 접종하였다. 그리고 접종 5, 7일 후에 잎에 발생한 잎마름병의 병반면적률(%)을 조사하였다. 실험한 유전자원 중에서, IT274921, IT304144, IT274929, IT274930은 잎마름병에 높은 저항성을 보였으며, IT330615와 IT288913은 잎마름병에 대하여 중도저항성을 보였다. 유전자원 IT299972, IT327434, IT337262, IT337275는 잎마름병에 대하여 높은 감수성을 나타내었다. 본 연구에서 선발한 잎마름병에 대한 저항성 유전자원들은 잎마름병 저항성 육종 시스템에 유용한 자원으로 이용될 수 있을 것이다.
Trans Abstract
Leaf blight of onion caused by Stemphylium vesicarium is the most destructive fungal disease worldwide, which leads to decrease quality and seed production of onion. This study was conducted to evaluate the resistance degree of 110 onion germplasm against S. vesicarium. To investigate resistance to leaf blight, the genetic resources of onion were tested by following method. Onion seedlings at four-leaf stage were rubbed with nonabsorbent cotton and inoculated with spore suspension (1.0×105 spores/ml of potato dextrose broth) of S. vesicarium by spray method. Five to 7 days after inoculation, infected leaf area (%) of onion seedling was measured. Our results showed that IT274921, IT304144, IT274929, and IT274930 lines exhibited the highest resistance against S. vesicarium. And IT330615 and IT288913 lines was identified as moderately resistant to leaf blight, whereas IT299972, IT327434, IT337262, and IT337275 lines were the most susceptible cultivars to the fungus. On the basis of the results, we suggest that the resistant genetic resources can be used a basic material for resistant onion breeding system against leaf blight.
서 론
양파(Allium cepa L.)는 백합과 파속(Allium spp.)에 속하는 작물로, 높은 영양분과 풍부한 맛으로 요리에 사용되는 필수적인 양념 채소이다(Kádasi Horáková 등, 2024). 또한 양파는 다양한 2차 대사물질인 세이핀, 티오스린, 쿼세틴과 캠퍼롤과 같은 플라보노이드 등의 파이토케미컬을 생산한다(Hussein 등, 2018; Lee와 Mitchell, 2011). 특히 양파에는 플라보노이드가 고함량으로 함유되어 있어 의료 목적으로도 사용된다(Kádasi Horáková 등, 2024; Javadzadeh 등, 2009). 이처럼 양파는 소비가 증가하고 있는 경제적으로 중요한 작물이다(Arshad 등, 2017; Luitel 등, 2023b; Manjunathagowda, 2022).
양파의 생산량은 홍수, 극도의 가뭄, 서리와 같은 비생물학적 요인들과 해충, 식물 병과 같은 생물학적 요인들로 인해 영향을 받는다(Kádasi Horáková 등, 2024; Mishra와 Gupta, 2012; Paibomesai 등, 2012). 양파에 발생하는 주요 병해 중 Stemphylium vesicarium에 의한 잎마름병은 잎과 꽃에서 발생하여 구근 수확량과 종자 품질을 떨어뜨리는 곰팡이 병이다(Chandel 등, 2022; Leach 등, 2020). 잎마름병은 열대지방에서 발생하는 주된 식물 병인데, 오늘날 기후 온난화로 인하여 예전에 양파 재배에 있어 가장 중요한 병해로 간주되었던 노균병(Peronos-pora destructor) 및 검은무늬병(Alternaria porri)보다 잎마름병이 더 중요한 병으로 여겨지고 있다(Chowdhury 등, 2015; Hay 등, 2019; Maude, 1990; Stricker 등, 2021). 특히 종자 생산용 양파 재배에서 잎과 종자 줄기에 잎마름병이 발생하게 되면 80-85%의 종자 생산량 손실을 일으킨다(Dangi 등, 2019; Hassan 등, 2020).
S. vesicarium은 양파 등의 Allium 속 식물 이외에도 망고, 배, 콩, 토마토, 아스파라거스, 알파파 등에서도 병을 일으킨다(Mishra 등, 2014). 잎마름병 병징은 점진적으로 괴사 병반이 전체로 확산이 되기도 하나 주로 잎의 끝부분이 말라지고 잎 전체를 걸쳐서 비대칭적으로 병반이 나타난다(Hay 등, 2019). 병이 점차 진전됨에 따라서 병반의 정중앙에 황갈색을 띄게 되며, 더 심해지면 지상부 전체로 확산되어 결국 마르게 된다(Basallote 등, 1993; Mishra 등, 2014).
양파 잎마름병을 방제하기 위해 주로 합성 작물보호제를 사용하여 왔으나, 저항성 균 출현으로 방제 효과가 떨어지고 있다(Hay 등, 2019). 뿐만 아니라 화학농약의 오남용으로 인하여 수질과 토양 오염뿐 아니라, 생태계의 교란 등 안전성 문제가 제기되고 있다(Aveling 등, 1993; Hay 등, 2019; Stricker 등, 2021). 이와 같은 이유로 친환경적인 방제 방법에 대한 요구가 증가하고 있다(Dangi 등, 2019; Ryu 등, 2015). 양파 잎마름병에 대한 친환경적 방제 방법으로는 생물적 방제제 처리, 윤작, 저항성 품종의 재배, 질소 비료를 과도하게 사용하지 않기, 재식 밀도 줄이기 등이 있다(Karabulut와 Gökçe, 2022; Mishra 등, 2014). 이들 중 저항성 품종의 재배는 식물 병을 방제하는 데 있어 환경 오염을 최소화하며, 생태계에 생물 다양성을 보존시켜 주는 가장 효과적인 방제 방법이다(Zheng 등, 2010).
양파 유전자원을 특징화하는 것은 유전적 변이성을 사용하여 새로운 품종을 개발하는 데 필수적이다(Luitel 등, 2023a). 따라서, 유전자원의 특성을 판단하고 이러한 유전자원 품종은 추후에 저항성 품종을 개발하기 위한 육종 시스템에 활용될 수 있다(Luitel 등, 2023a; Sharma 등, 2018). 따라서 저항성 품종을 개발하기 위해서는 저항성 유전자원의 발굴이 선행되어야 한다(Wang 등, 2019). S. vesicarium에 의한 잎마름병에 대한 저항성 양파 유전자원으로, Sharma와 Sain (2003)은 인도에서 선발된 양파 품종 ‘ RO-1’이 Stemphylium 잎마름병에 대하여 중도저항성을 보인다고 하였다. 그리고 Behera 등(2013)은 22개 자원의 포장 검정을 통하여 중도저항성인 ‘ VG-18’ 자원을 보고하였으며, Dangi 등(2019)은 인공접종한 포장실험을 통하여 59개 자원의 잎마름병에 대하여 저항성을 검정하여 중도저항성을 보이는 ‘ Pusa Soumya’ (A. fistulosum L.)와 ‘ Red Creole 2’ (A. cepa)와 감수성을 보이는 ‘ Red Creole 1’ (A. cepa)을 선발하였다. 최근에 우리나라에서 많은 양파 유전자원이 수집되어 왔지만, 이들 유전자원의 잎마름병 저항성에 대해서는 거의 알려지지 않았다(Luitel 등, 2023b).
본 연구는 잎마름병 저항성 양파 품종 육성을 위한 저항성 유전자원을 발굴하기 위하여, 포장 검정이 아닌 Lee 등(2022a)이 개발한 양파 유묘를 이용한 생물검정법을 사용하여 국립농업과학원 농업유전자원센터로부터 분양받은 양파 유전자원 110점의 S. vesicarium KACC 44530 균주에 대한 저항성 정도를 조사하였다.
재료 및 방법
식물체 재배.
잎마름병에 대한 저항성 양파 유전자원을 발굴하고자, 농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터로부터 다양한 국가로부터 수집한 양파 유전자원 110점을 분양받았다(Table 1). 그리고 대조구로 감수성 품종인 ‘레드원볼 1115’(아시아 종묘)를 함께 실험하였다(Lee 등, 2022a).
List of 110 onion germplasm resources used in this study
양파 유전자원의 잎마름병에 대한 저항성을 검정하기 위하여, 8×16 육묘용 연결포트(포트당 토양 15 ml; Bumnong, Jeon-gup, Korea)에 원예용상토 2호(Punong, Gyeongju, Korea)를 채우고, 양파 종자를 포트당 1립씩 파종하고, 온실(25°C±5°C)에서 수분을 공급하면서 재배하였다. 파종하고 약 65일 재배한 후에 플라스틱 포트(직경 6.8 cm, 토양 160 ml)로 식물체를 이식하고 지지대와 철사를 이용하여 줄기와 잎을 고정하고 재배하였다. 약 100일 동안 재배한 4엽기 양파 식물체를 실험에 사용하였다.
Stemphylium vesicarium 균주.
양파 잎마름병원균인 S. vesicarium 균주는 농촌진흥청 농업유전자원센터(KACC; Rural Development Administration, Jeonju, Korea)로부터 분양받은 KACC 44530 균주를 −80°C에 저장하면서, 균주의 병원성이 떨어지지 않도록 계대배양을 최소화하기 위하여, 사면배지에서 1회만 평판배지로 이식하는 방법으로 증식하면서 실험에 사용하였다.
접종원 준비.
재배한 양파 유전자원에 접종할 S. vesicarium KACC 44530 균주의 포자를 생산하기 위하여, 직경 8.5 cm petri dish에 준비한 potato dextrose agar (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 KACC 44530 균주를 접종하고, 25°C에서 7일 동안 배양하였다. 전배양한 KACC 44530 균주의 균총으로부터 균사 조각을 떼어내어 직경 8.5 cm petri dish의 rice bran agar (rice bran 32 g, glucose [Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan] 10 g, agar [Junsei Chemical Co., Ltd.] 12 g, 증류수 1 l) 배지에 3조각씩 올려놓고 25°C에서 11일 동안 배양하였다. 그 후에 포자형성을 위하여 배양한 S. vesicarium 균주의 균총을 멸균한 붓으로 긁어주고, 25°C 항온항습실(상대습도 80%)에서 petri dish 뚜껑을 열어놓고 하루에 12시간씩 광(55 µmol/m2·s)을 조사하면서 48시간 동안 배양하였다. 여기에 멸균한 1/2 농도의 potato dextrose broth (Becton, Dickinson and Co.) 용액을 부어주고, 멸균한 붓으로 포자를 수확한 후에, 이를 4겹 가제로 걸러 병원균의 균사체를 제거하여 포자현탁액을 준비하였다(Lee 등, 2022a). 그리고 광학현미경(BX53F; Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 hemocytometer (Paul Marienfeld GmbH & Co. KG, Lauda-Königshofen, Germany)를 이용하여 ml당 포자 수를 조사하고, 멸균수로 희석하여 접종원 농도를 1.0×105 spores/ml과 3.0×105 spores/ml로 조정한 후에 실험에 사용하였다(Lee 등, 2022b).
접종 및 발병.
온실에서 재배한 4엽기 양파 유묘에, 양파 잎마름병균을 접종하기 직전에 잎의 큐티클에 상처가 생기도록 하기 위하여 탈지하지 않은 비흡수성 재질의 솜으로 양파의 잎을 가볍게 문지른 후에(Shishkoff와 Lorbeer, 1989), 준비한 KACC 44530 균주의 포자현탁액(1.0×105 spores/ml)을 스프레이를 사용하여 흘러내리기 직전까지 분무하여 접종하였다. 잎마름병균을 접종한 양파 유묘는 20°C 습실상에서 48시간 습실처리하고, 항온항습실(25°C, 상대습도 80%)로 이동하여 하루에 12시간씩 광(55 µmol/m2·s)을 조사하면서 저면관수로 재배하였다(Lee 등, 2022b).
선발한 4개 저항성 유전자원의 접종 농도에 따른 잎마름병 발생 실험은 접종 농도를 2가지(1.0×105 spores/ml과 3.0×105 spores/ml)로 접종한 것을 제외하고 나머지는 동일한 방법으로 실험하였다.
병 조사.
감수성 대조품종 ‘레드원볼1115’의 잎마름병 발생 정도를 관찰하면서, 양파 유전자원 110점의 잎마름병 발생을 조사하였다. 접종 5일과 7일 후에 1-3엽에 대하여 각 엽에 발생한 잎마름병 병반면적률(%)을 조사하고, 이들의 평균값을 계산하여 이를 각 식물체의 병반면적률(%)로 하였다. 그리고 이를 바탕으로 아래와 같은 수식에 따라 병진전곡선하면적(area under disease progress curve, AUDPC)을 계산하였다(Jeger와 Viljanen-Rollinson, 2001).
n=병 조사 수, ti= i 병 조사 일의 접종 후 경과 일수, DSi= i 병 조사 일의 병반면적률(%).
통계 분석.
모든 실험은 처리당 5개 식물체를 접종하였으며, 실험은 3회 반복하여 수행하였다. 그리고 이들 결과는 SAS 프로그램(SAS 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 ANOVA 분석을 하고, 처리 평균 간 비교를 위하여 Duncan's multiple range test (P=0.05)를 실시하였다.
결과 및 고찰
농촌진흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터로부터 분양받은 양파 유전자원 110점의 잎마름병에 대한 저항성을 S. vesicarium KACC 44530 균주를 접종하여 검정한 결과, 접종 5일 후에 잎마름병 발생을 조사하였을 때에는 실험한 품종 중 IT274921, IT304144, IT274929, IT274930은 통계적으로 차이가 없는 낮은 병반면적률인 0.9%, 1.1%, 4.8%, 6.4%를 각각 나타냈다(Table 2). 이와 달리 IT299972, IT337263, IT327434, IT337262는 실험한 품종 중 67.8%, 64.1%, 63.7%, 63.5%의 높은 병반면적률을 보였다(Table 2). 그리고 함께 실험한 대조품종 중 감수성 품종인 ‘레드원볼 1115’는 49.3%의 병반면적률을 나타냈다. 따라서 4개 유전자원(IT274921, IT304144, IT274929, IT274930)은 S. vesicarium KACC 44530 균주에 대해 강한 저항성을 보인다고 생각되었다.
접종 5일과 7일 후에 조사한 병반면적률(%)을 바탕으로 각 유전자원의 AUDPC를 계산한 결과, 실험한 품종 중 IT274921, IT304144, IT274929, IT274930은 통계적으로 유의차 없이 실험한 품종 중 낮은 AUDPC 값을 보였으며, 특히 IT274921은 가장 낮은 3.1의 AUDPC 값을 보였다(Table 2, Fig. 1). 이와 달리 IT299972, IT327434, IT337262, IT337275는 각각 147.3, 136.3, 135.4, 135.2의 높은 AUDPC 값을 나타냈다. 그리고 감수성 대조품종 ‘레드원볼 1115’의 AUDPC는 110이었다(Table 2). 따라서 실험한 유전자원 중 IT274921, IT304144, IT274929, IT274930은 잎마름병에 높은 저항성을 나타냈고(Table 2, Fig. 1A-D), IT299972(Fig. 1G), IT327434, IT337262, IT337275 (Fig. 1H), IT337263, IT337283, IT299976, IT337256은 잎마름병에 대해 높은 감수성 품종이라고 생각되었다(Table 2).
Development of Stemphylium leaf blight on seedlings of eight onion cultivars 7 days after inoculation of Stemphylium vesicarium KACC 44530. (A) ‘IT274921’; (B) ‘IT274929’; (C) ‘IT274930’; (D) ‘IT304144’; (E) ‘IT288913’; (F) ‘IT337291’; (G) ‘IT299972’; and (H) ‘IT337275’.
저항성으로 선발한 4개 유전자원에 대하여 접종 농도를 1.0×105 spores/ml과 3.0×105 spores/ml로 접종하고 5일 후에 잎마름병 발생을 조사한 결과, IT274921은 각각 0.6%와 17.8%, IT304144는 1.1%와 21.1%, IT274930은 1.7%와 35.6% 그리고 IT274929는 7.8%와 37.8%의 병반면적률(%)을 보였다(Fig. 2). 즉, 4개 유전자원 모두 3.0×105 spores/ml로 접종하였을 때는 1.0×105 spores/ml로 접종하였을 때보다 잎마름병 발생이 증가하였다. 저항성 유전자원으로 선발한 4개 유전자원 중 IT274921은 타지키스탄에서 확보한 ‘ TJK 35-6’ 자원이고, IT304144는 조지아로부터 도입한 ‘ GEO-PHJ-2015-7-8’ 자원이다. 그리고 IT274929과 IT274930은 불가리아로부터 도입한 자원으로 자원명은 각각 ‘ A7E0252’와 ‘ A7E0604’이다(Table 1). 그리고 이들은 실험을 위해 재배하였을 때 다른 양파 유전자원과 잎 모양이 다른 즉, 원통형이 아닌 마늘과 같은 잎형태를 보였다(Fig. 1). 따라서 농업유전자원센터에서는 양파로 공시하고 있으나, 잎 모양으로 판단할 때 코끼리마늘의 재배종인 leek (Allium ampeloprosum var. porrum)일 수도 있다.
Development of leaf blight on four onion cultivars caused by Stemphylium vesicarium according to concentration of spore suspension. Seedlings at four-leaf stage were inoculated with S. vesicarium KACC 44530 by spraying spore suspension of the fungus at concentrations of 1.0×105 and 3.0×105 spores/ml. The plants were incubated in a humidity chamber at 20°C for 48 hr and then transferred to a growth chamber at 25°C and 80% RH with a 12-hr light/dark cycle. Disease severity was measured 5 days after inoculation and represented as percentage of infected leaf area. The data were obtained from one run with three replicates each. Values labeled with the same letter within each line are not significantly different based on Duncan's multiple range test at P=0.05.
둥근 모양을 하고 있는 파와는 달리 엽신 안쪽이 반원형으로 들어가 있는 속이 빈 관 모양의 전형적인 양파 잎 모양을 보이는 유전자원, 즉 오동정 자원을 제외한 양파 유전자원 중에서 IT330615는 접종 5일 후에 18.9%의 병반면적률(%)을 보였으며, AUDPC는 40.0 값을 보여 가장 낮은 잎마름병 발생을 보였다(Table 2). 그 다음은 IT288913이 낮은 잎마름병 발생을 보였는데, 접종 5일 후의 25.6% 병반면적률(%)과 55.3의 AUDPC 를 나타냈다(Table 2, Fig. 1E). 따라서 실험한 양파(A. cepa) 유전자원 중 잎마름병에 대하여 가장 높은 저항성을 보이는 유전자원은 IT330615이고, 그 다음은 IT288913이었다. IT330615는 타지키스탄으로부터 도입한 ‘ CHN-CHOMC-2002-40’ 자원이고, IT288913은 중국으로부터 도입한 ‘ CHN-CHOMC-2002-40’ 자원이었다(Table 1).
본 연구에서 양파 유전자원의 잎마름병에 대한 저항성 검정에 사용한 S. vesicarium KACC 44530 균주는 충남 예산에서 채집한 마늘(A. sativum)로부터 분리한 균주로, Lee 등(2022a)이 실험한 6개 균주 중 가장 높은 병원력을 나타낸 균주이다. 유전자원의 저항성이 질적 저항성의 경우에는 실험하는 균주의 병원력에 따른 저항성 차이가 거의 없으나, 잎마름병에 대해 질적 저항성으로 보고된 양파 유전자원은 거의 없다. 유전자원의 저항성이 양적 저항성의 경우에는 Fig. 2처럼 접종 농도의 증가에 따라 저항성 정도에 차이를 보이고, 균주의 병원력에 반비례하게 저항성을 나타낸다는 보고들이 있으므로(Jo 등 2014, 2016; Lee 등, 2024), 선발된 유전자원 IT274921, IT304144, IT274929 및 IT274930 그리고 IT330615와 IT288913 자원은 KACC 44530 균주보다 병원력이 더 낮은 S. vesicarium 균주들에 대해서는 더 높은 저항성을 보일 것으로 추정되었다. 따라서 유전자원 IT274921, IT304144, IT274929 및 IT274930 그리고 IT330615와 IT288913은 잎마름병 저항성 육종에서 이용될 수 있을 것으로 생각되었다. 그리고 실험한 유전자원 중 8종 유전자원(IT299972, IT327434, IT337262, IT337275, IT337263, IT337283, IT299976, IT337256)은 감수성 대조품종인 ‘레드원볼 1115’보다 통계적으로 유의성 있게 높은 AUDPC 값을 보여, 이들은 잎마름병에 대하여 매우 감수성인 것으로 생각되었다(Table 2). 따라서 이들 유전자원은 양파 잎마름병 저항성 검정에서 감수성 대조품종으로 사용될 수 있을 것이다.
Notes
Conflicts of Interest
No potential conflict of interest relevant to this article was reported.
Acknowledgments
This study was carried out with the support of the Cooperative Research Program for Agriculture Science and Technology Development (Project no. PJ01481604), the Rural Development Administration, Republic of Korea and the Korea Research Institute of Chemical Technology (KRICT) in-tramural funding [KK2461-10].