*Corresponding author 서 론
상추는 주로 시설 내에서 연중 재배되고 있는데, 재배면적 약 2,916 ha, 생산량은 82,938톤에 달한다(Statistics Korea, 2020). 우리나라 상추 시설 재배에서는 연작으로 인해 노균병(downy mildew), 균핵병(sclerotinia rot), 시들음병(fusarium wilt), 잿빛곰팡이병(gray mold) 등의 발생이 많으며, 노균병, 균핵병, 잿빛곰팡이병은 저온다습인 조건에서 주로 발생하고 있다(Lee, 2004; Nam, 2001). Sclerotinia minor와 S. sclerotiorum은 상추 균핵병의 원인이 되는 주요 병원균으로 식물의 지상부의 감염은 균핵에서 형성된 자낭반에서 형성된 자낭포자로부터의 감염이 원인이 되며, 지하부의 감염은 균핵에서 발아한 균사로 인한 감염이 주된 원인으로 병 발생은 환경적인 조건에 따라 다르다(Abawi와 Grogan, 1979; Subbarao, 1998).
균핵병의 방제에는 화학적, 경종적, 생물학적 방제 방법이 있는데, 균핵병의 방제에 있어 화학농약을 이용한 방제는 농약의 인축독성의 위험과 환경오염에 대한 우려로 화학농약의 사용을 줄여야 한다는 추세와 함께 길항미생물을 이용한 생물학적 방제제에 대한 관심과 연구가 증가하고 있다(Bardin과 Huang, 2001). 특히 Bacillus spp.는 빠르게 증식하고 내생포자를 만드는 특성과 식물병원균에 대한 넓은 범위의 방제 능력으로 인해 미생물 제제의 활용이 주목받고 있다(Cavaglieri 등, 2005). Bacillus spp.가 내생포자를 만들어 오랜 기간 동안 생존할 수 있다는 생태학적인 특징은 생물학적 방제제로의 상업화가 용이하다는 이점을 제공한다(Pérez-García 등, 2011).
Bacillus spp.는 ammonia, siderophore, hydrogen cyanide, indole acetic acid (IAA) 등의 다양한 plant growth-promoting (PGP) 물질을 분비하는 경쟁적 길항작용(Stein, 2005), β-1,3-glu-canase, protease, chitinase 등의 가수 분해효소로 병원균의 세포벽을 분해하는 용균작용, 항진균성 생산 물질로 직접 병원균의 생육을 저하시키는 항생작용 등의 기작으로 생물학적 방제제로서 기능한다(Jangir 등, 2018). 또한 식물 생장 촉진자(PGP), 전신 저항성 유도자(systemic resistance inducer), 다양한 종류의 항생 물질 분비 및 효소 분비와 식물병원균에 대해 군집화(colonization)를 통해 영양분 같은 식물의 생장 요소에 대해 경쟁 등의 역할을 하는 것으로 보고되었다(Shafi 등, 2017).
따라서, 본 연구에서는 토마토 잎에서 분리한 B. amyloliquefaciens HY를 대상으로 상추 균핵병에 대해 생물학적 방제 효과 및 식물 생장 촉진세균으로서의 활용 가능성을 확인하고자 수행하였다.
재료 및 방법
Bacillus amyloliquefaciens HY 의 분리 및 동정
본 연구에서 사용된 길항세균 균주는 서울시립대학교 온실 내 재배 중인 대과토마토에서 무작위로 수집된 잎을 무균상 내에서 화염 살균된 핀셋을 이용하여 potato dextrose agar (PDA; Difco, Sparks, MD, USA)에 잎의 앞면과 뒷면을 한 번씩 찍어서 25°C, 12시간 광/암 조건 하에서 7일간 배양하였다. 배양된 엽권 미생물 중 다른 미생물과 inhibition zone을 형성한 미생물을 확인하였고 해당 균주를 상추 균핵병균과의 대치배양을 통해 길항력이 우수한 균주를 분리·선발하였다. 선발한 균주를 동정하기 위한 실험은 바이오닉스(Bionics, Seoul, Korea)를 통해 수행되었다. Genomic DNA 상의 16S ribosomal RNA 서열을 27F 프라이머 및 1492R 프라이머(Johnson 등, 2019)를 사용하여 sequencing하고, National Center for Bio-technology Information (NCBI; Bethesda, MD, USA) BLAST 알고리즘을 사용하여 기존에 알려진 여러 균주의 16S rRNA 서열과 비교하였다. Multiple alignments와 phylogenetic tree는 MAFFT package (Katoh와 Standley, 2013)를 이용하여 작성되었다.
Bacillus amyloliquefaciens HY 의 상추 균핵병균 균사 생장 억제 효과
상추 균핵병균에 대해 B. amyloliquefaciens HY의 균사 생장 억제능을 확인하기 위해 대치배양 실험을 실시하였다. 길항세균은 −70°C의 초저온 냉동고에서 glycerol stock으로 보관 중인 B. amyloliquefaciens HY를 사용하였다. B. amyloliquefaciens HY 균주는 tryptic soy agar (TSA; Difco) 배지에 도말하여 인큐베이터에서 25°C, 72시간 동안 배양한 뒤 실험에 사용하였다. 상추 균핵병균은 상추에서 순수 분리하여 PDA 배지에서 형성된 균핵 상태로 냉장고에 보관 중인 것을 사용하였다. 실험은 PDA 배지 중앙에 백금이를 이용하여 B. amyloliquefaciens HY를 획선도말하고 양쪽에 25°C, PDA에서 배양한 균핵병균의 균총을 직경 6.5 mm 코르크보어로 채취하여 치상하였다. 대조구는 배지 한 쪽에 균핵병균의 균총조각만 치상하여 처리구와 비교하였다. 대조구의 균핵병균의 균사가 배지 끝까지 자랐을 때 대조구 대비 처리구의 균사를 측정하여 균사 생장 억제율을 조사하고, 처리구의 균핵병균의 균사 끝부분을 광학현미경을 통하여 관찰하였다. 균사 생장 억제율은 다음과 같은 계산식으로 데이터를 산출하였다: 균사 생장 억제율(%) = (1 - 처리구의 균사 생장 속도 / 무처리구의 균사 생장 속도) ×100.
Bacillus amyloliquefaciens HY의 휘발성 물질에 의한 균핵병균의 균사 생장 억제 및 균핵 발아 억제 효과
B. amyloliquefaciens HY의 휘발성 물질이 균핵병균의 균사 생장과 균핵 발아에 미치는 영향을 조사하기 위해 I-plate petri-dish를 사용하여 실험하였다. I-plate의 한 쪽에는 TSA 배지를 분주하고 다른 한 쪽에는 PDA 배지를 분주하였다. Glycerol stock으로 −70°C에 보관 중인 B. amyloliquefaciens HY 균주의 배양현탁액을 100 µl를 추출하여 tryptic soy broth (TSB; Difco) 배지에서 shaking incubator에 넣고 150 rpm, 25°C 그리고 72시간 동안 암 조건에서 배양하였다. 그 후 B. amyloliquefaciens HY 균주의 배양현탁액을 100 µl 추출하여 I-plate의 TSA 배지에 도말하고 나머지 I-plate의 PDA 배지에는 균핵병균의 균총조각과 균핵을 각각 치상하고, 암 조건에서 25°C로 배양하였다. 균사 생장 억제 실험은 7일간 수행되었으며, 균핵 발아 억제 실험은 10일간 수행되었다. 본 실험은 2020년 6월부터 7월에 걸쳐 수행되었다.
Bacillus amyloliquefaciens HY의 식물 생장 촉진 활성 및 진균 세포벽 분해효소 생성능
기내에서 B. amyloliquefaciens HY가 생산하는 식물 생장 촉진물질과 진균 세포벽 분해효소 활성을 검정하였다.
Siderophore 생산능.
Siderophore 생산능은 chrome azurol S (CAS) agar 배지를 이용하여 실험하였다. 증류수 50 ml에 CAS (Sigma, St. Louis, MO, USA) 염료 용액 60.5 mg을, 증류수 40 ml 에 hexadecyltrimethylammonium bromide 72.9 mg을, 증류수 900 ml에 Luria-Bertani agar 35 g을 녹였다. 위 세 가지 용액을 혼합하여 고압멸균하였다. Hydrogen chloride (HCI) 용액(10 mM) 10 ml에 1 mM FeCI3·6H2O를 녹여 섞어주고 고압멸균하였다. 두 가지의 용액을 50°C까지 식히고 혼합하여 분주해 CAS 배지를 제조하였다. 이후 배지의 중앙에 멸균된 0.8 mm paper disc 를 올린 후 B. amyloliquefaciens HY 배양액을 마이크로피펫을 이용하여 20 µl를 처리하고 28°C에서 5일간 배양한 후 orange halo zone 형성을 관찰하였다(Louden 등, 2011).
인산 분해능
인산 분해능(phosphate solubilization)은 Pikovskaya (PVK) agar 배지를 이용하여 실험하였다. 1 l의 증류수에 glucose, 10 g; Ca3(PO4)2, 5 g; yeast extract, 0.5 g; (NH4)2 SO4, 0.5 g; KCl, 0.2 g; NaCl, 0.2 g; MgSO4·H2O, 0.1 g; MnSO4·H2O, 0.002 g 그리고 FeSO4·7H2O, 0.002 g; Bacto agar 15 g를 넣고 교반하며 HCl을 이용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 고압멸균 후 분주하여 PVK 배지를 제조하였다. 위와 같은 방법으로 배지에 B. amyloliquefaciens HY 배양액을 마이크로피펫으로 추출하여 멸균한 0.8 mm paper disc에 처리한 후, 26°C에서 14일간 배양한 후 clear halo zone 형성을 관찰하였다(Nautiyal, 1999).
Chitinase 생산능
Chitinase 생산능을 확인하기 위해 Chitin agar를 이용하여 실험하였다. Chitin powder (Sigma) 40 g을 600 ml의 concentrated HCl에 천천히 넣어 교반기에서 30°C로 한 시간 동안 교반한 후 2 l의 물을 천천히 넣어준 후 거즈를 이용하여 chitin을 걸러내어 주었다. 이 거름작업을 현탁액의 pH가 3.5가 될 때까지 반복한 후, 남아있는 chitin을 걸러내어 건조기를 이용하여 물기를 제거하여 colloidal chitin을 제조하였다. 이렇게 제조한 colloidal chitin을 이용하여 chitin agar 배지를 제조하였다(colloidal chitin 1% [10 g], Na2 HPO4, 6 g; KH2 PO4, 3 g; NH4 Cl, 1 g; NaCl, 0.5 g; yeast extract, 0.05 g; Bacto agar 15 g per 1 l). 배지의 중앙에 멸균된 0.8 mm paper disc를 올린 후 B. amyloliquefaciens HY 배양액을 마이크로피펫을 이용하여 20 µl를 처리하고 37°C에서 4일간 배양한 후 clear halo zone 형성을 확인하였다(Kuddus와 Ahmad, 2013).
Protease 생산능
Protease 생산능은 skim milk agar 배지를 사용하여 확인하였다. 증류수 500 ml에 skim milk 10 g 을 녹이고 Bacto peptone를 1 g 그리고 NaCl를 2 g 넣고, 증류수 500 ml에 Bacto agar를 18 g 녹인 후, 두 용액을 따로 고압멸균하여 40-50°C로 식혀 혼합하고 분주하였다. 그 후 skim milk agar 배지 중앙에 B. amyloliquefaciens HY 배양액을 마이크로피펫으로 추출하여 멸균한 0.8 mm paper disc에 20 µl를 처리하고, 25°C에서 2일간 배양한 후 clear halo zone 형성을 관찰하였다(Alnahdi, 2012).
B. amyloliquefaciens HY와 sideropore 생산능, 인산 분해능, chitinase 생산능, protease 생산능을 비교하기 위해 기존의 sideropore 생산능, 인산 분해능, protease 생산능이 확인된 B. subtilis YGB36(안동대학교 분양 균주)와 상추 균핵병에 대해 방제 효과가 확인된 B. subtilis GG95(경기도 농업기술원 분양 균주)를 실험에 사용하였다(Lee 등, 2014, 2020). 또한 해당 실험들의 대조구로는 0.8 mm paper disc에 TSB 배지를 20 µl를 처리하였고, 실험은 3 반복으로 수행되었다.
상추 균핵병에 대한 Bacillus amyloliquefaciens HY의 방제 효과
B. amyloliquefaciens HY의 길항 효과를 검정하기 위해 온실 실험과 생육상(growth chamber; Vision scientific Co., Daejeon, Korea) 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 상추는 ‘뚝섬적축면’을 사용하고, 200공 플러그 트레이에 상추 종자를 파종하여 30일 정도 육묘한 후 병원균의 접종을 위해 유묘를 직경 9 cm 포트에 이식할 때 함균 상태의 PDA 배지에 발아시킨 균핵과 PDA 배지를 코르크보어를 이용하여 8.5 mm 크기로 잘라 상추묘의 근권부에 대각선으로 4개를 접종한 뒤 살균된 상토로 채웠다. 길항세균은 −70°C 초저온냉동고에서 glycerol stock 형태로 보관 중이던 B. amyloliquefaciens HY를 상온에 녹이고 500 ml TSB 배지에 100 µl를 마이크로피펫을 이용하여 넣고, 진탕배양기에 48시간 동안 25°C, 150 rpm으로 배양하였고 상추의 처리 농도는 optical density (OD) 600 nm 기준으로 1.5로 조정하여 처리하였다. 또한 평판희석법으로 길항세균의 농도를 측정한 결과 1×108 cfu/ml로 나타났다. 배양한 B. amyloliquefaciens HY의 배양현탁액을 각각 멸균증류수로 10배, 50배, 100배 희석하고 포트당 100 ml씩 관주 처리하였다. 처리는 7일 간격으로 3회 처리해주었다. 또한 기존 농약과 길항미생물의 비교를 위해 플루디옥소닐 액상수화제(fludioxonil SC)를 관주처리 농도에 따라 2,000배 희석하여 포트당 100 ml로 처리하였다. 처리 후 30일간 온실에서 재배하면서 상추의 생존율을 조사하였다. 본 실험은 2021년 3월부터 4월에 걸쳐 20 반복으로 수행되었다.
또한, 생육상 실험을 위하여 동일한 방법으로 전처리 후 12시간 광 조건, 주간 온도 25°C, 야간 온도 15°C 그리고 상대습도 95%로 설정한 생육상에서 재배하면서 상추의 생존율을 조사하였다. 본 실험은 2021년 6월부터 7월에 걸쳐 10 반복으로 수행되었다: 상추 생존율(%) = 생존한 상추 개체수 / 전체 상추 개체수 × 100.
결과 및 고찰
Bacillus amyloliquefaciens HY의 분리 및 동정
상추 균핵병균과 대치배양을 통해 선발된 HY 균주의 게놈 DNA를 추출하여 16S ribosomal RNA 유전자를 polymerase chain reaction (PCR)으로 증폭하여 확보한 뉴클레오타이드 시퀀스(nucleo-tide sequence)를 확보하였다. 확보한 1471 base-pair의 16S ribosomal RNA 유전자 서열을 비교한 결과, HY 균주는 Bacillus sp.에 속하는 것으로 생각되며 기존에 보고된 B. amyloliquefaciens와 99.8%의 상동성을 나타냈다(Fig. 1).
Bacillus amyloliquefaciens HY과 상추 균핵병균과의 균사 생장 억제 효과
선발된 B. amyloliquefaciens HY와 상추 균핵병균의 대치배양 결과(Table 1, Fig. 2), 대조구에 비해 70.7%의 균사 생장 억제율을 나타냈다. 광학현미경으로 처리구의 억제존(inhibition zone)의 균사를 관찰하였을 때, 표면이 일정한 대조구의 균사에 비해 균사의 끝부분이 부풀고 불규칙한 정상적이지 않은 균사의 형태를 확인할 수 있었다(Fig. 3). B. subtilis와 같은 길항미생물은 식물 병원균에 대해서 균사의 세포벽에 구멍이 형성되고, 파괴되며, 기형적인 모습을 보이는 등 형태학적 변화가 일어난다고 보고하였다. 이는 길항미생물에 의한 항진균적 대사산물의 작용에 의한 것이라고 알려져 있다(Sharma와 Sharma, 2008). 또한 B. amyloliquefaciens는 S. sclerotiorum에 대해 기내 상태에서 균사 생장을 억제하고 균핵의 생성을 억제할 뿐만 아니라 균사의 세포벽 붕괴, 비정상적인 자낭반, 자낭포자의 분출 실패 등을 초래하였다고 보고되었다(Rahman 등, 2016).
Fig. 2.
Inhibition of mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum by Bacillus amyloliquefaciens HY. Pictures were taken when fungal mycelia in control reached the end of the potato dextrose agar. Full plate growth on the control (A). Mycelial growth inhibition was observed as a distinct zone of inhibition with B. amyloliquefaciens HY treatment on a dual-culture plate (B).
Fig. 3.
Dual-culture assay and microscopic observation of the antagonistic effect of Bacillus amyloliquefaciens HY against Sclerotinia sclerotiorum. Normal hypha (A) and mycelial growth inhibition (B-D) was observed as a distinct zone of inhibition with the bacterial treatment on a dual-culture plate and hyphae were also degenerated, shrunken, and acquired an irregular and cell wall and mycelial tip lysis with blackening of hyphae by the treatment of B. amyloliquefaciens HY.
Bacillus amyloliquefaciens HY의 휘발성 물질에 의한 상추균핵병균의 균사 생장 억제 및 균핵 발아 억제 효과
B. amyloliquefaciens HY가 생성하는 휘발성 물질이 상추 균핵병균의 균사 생장과 균핵의 발아에 미치는 영향을 I-plate를 사용하여 실험한 결과(Table 2, Fig. 4), 균사 생장 억제율은 대조구 대비 57.7%를 나타냈고, 균핵 발아 억제율은 46.7%를 나타내어 균사 생장과 균핵 발아 모두 길항세균의 휘발성 물질에 의해 억제되는 모습을 나타냈다.
Fig. 4.
Mycelial growth and sclerotia germination were suppressed by Bacillus amyloliquefacien s HY volatile compounds (A-D). Full-plate growth on the control plate of the I-plate petri-dish assay (A) and the volatile compounds of B. amyloliquefacien s HY inhibited the mycelial growth (B). All sclerotia were germinated as a control (C) and the volatile compounds of B. amyloliquefacien s HY inhibited the germination of sclerotia (D).
Table 2.
Effects of volatile compounds produced by Bacillus amyloliquefaciens HY on mycelial growth of Sclerotinia sclerotiorum and sclerotial germination on I-plates
| Treatment | Sclerotinia sclerotiorum | |
|---|---|---|
| Mycelial growth inhibition (%)a | Sclerotial germination inhibition (%)b,c | |
| Control | 0 | 0 |
| B. amyloliquefaciens HY | 57.7 | 46.7 |
Massawe 등(2018)은 Bacillus spp.의 휘발성 유기 화합물이 균핵의 생산을 감소시키고 S. sclerotiorum의 균사 생장을 억제한다고 보고하였다. 또한 B. amyloliquefaciens를 대상으로 GC-MS 분석을 진행한 실험 결과에 따르면, diacetyl (2,3-butane-dione)과 acetoin (3-hydroxy-2-butanone)의 높은 생산이 확인되었고(Asari 등, 2016), Wu 등(2019)의 결과에 따르면 B. amyloliquefaciens의 GC-MS 결과 2-dodecanone, 2-heptanone, 2-ethyl-1-hexanol, 2-nonanone, acetoin, 2-undecanone, 2-tridecanone, 2-undecanol이 검출되었고, 그중 2-nonanone 과 2-haptanone이 Fusarium oxysporum의 균사 생장 억제에
이상의 결과로서 B. amyloliquefaciens HY가 생성하는 휘발성 물질이 상추 균핵병균의 균사 생장을 억제하고, 균핵의 발아를 억제하는 것으로 나타났다.
Bacillus amyloliquefaciens HY의 PGP 활성 및 분해효소 생산 검정
B. amyloliquefaciens HY의 PGP 활성과 병원균을 직접적으로 저해하는 분해효소 생산 여부를 검정하기 위해 실험을 수행한 결과, B. amyloliquefaciens HY 균주는 CAS 배지, Pikovskaya 배지, Skim milk 배지에서 모두 paper disc 주변으로 halo zone (clear zone)을 형성하여, siderophore, 인산 분해능, protease 생산 능력이 확인되었다. Chitin 배지에서는 clear zone 을 형성하지 못하였다. 이와 같은 결과는 B. subtilis YGB36과 B. subtilis GG95에서도 동일한 결과를 나타냈다(Table 3, Fig. 5).
Fig. 5.
Four media for screening bacterial plant growth-promoting activity and lytic enzyme production. Halo zone appears when the bacteria have ability to produce specific substances (A-P). Chrome azurol S media for screening siderophore production. Orange zone appeared around the paper disc (B-D). Pikovskaya agar for screening bacterial phosphate solubility. Clear zone appeared around the paper disc (F-H). Chitin agar for screening chitinase production. No clear zone appeared (J-L). Skim milk agar for screening protease activity. Clear zone appeared around the paper disc (N-P). B. amy. HY, Bacillus amyloliquefaciens HY; B. sub. YGB36, Bacillus subtilis YGB36; B. sub. GG95, Bacillus subtilis GG95.
Table 3.
Comparison of three Bacillus spp. for bacterial plant growth-promoting, lytic enzyme activity
| Isolates | Siderophore production | Phosphate solubilization | nChitinase | Protease |
|---|---|---|---|---|
| B. amyloliquefaciens HY | + | + | - | + |
| B. subtilis YGB36a | + | + | - | + |
| B. subtilis GG95b | + | + | - | + |
Siderophore는 철을 킬레이트화하는 데 사용되는 리간드(ligands)로서 분류되며(Louden 등, 2011), 근권부 세균에 의해 주로 생산되는 siderophore는 근처 뿌리에 철 흡수율을 증가시켜 식물의 생장을 촉진한다고 알려져 있다(Alexander와 Zuberer, 1991). 이와 더불어 근권부 세균은 siderophore 생산을 통해 병원균의 생장을 억제하여 식물을 보호한다고 보고되었다(Whipps, 2001).
일반적으로 토양 내에서 많은 양의 인이 존재하고 있지만, 용해되지 않은 채로 남아 있고(Abd-Alla, 1994), 그중 식물체가 흡수할 수 있는 인의 비율은 한정적이고, 평균적으로 micromolar 단위 또는 그보다 적은 양만을 식물이 사용할 수 있다(Khan 등, 2007). Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR)는 식물체에 난용성 인산염을 가용화하거나, 식물이 흡수하기 어려운 영양소를 흡수할 수 있도록 가용화하는 방식으로 식물체의 성장을 직접적으로 유도한다(Persello-Cartieaux 등, 2003). 고정된 토양 내의 인을 용해할 수 있는 세균을 종자나 토양에 처리하는 방법으로 작물의 생산량을 증가시켰다고 보고되어 있다(Abd-Alla, 1994; Jones와 Darrah, 1994).
Skim milk agar를 이용한 protease 검출 실험에서 B. amyloliquefaciens HY가 protease 활성을 나타냈다. 이와 더불어 B. amyloliquefaciens HY는 siderophore 생산능과 인산을 용해능이 확인되었다.
Protease는 다른 단백질의 아미노산간 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소로서, Dunne 등(1997)은 Stenotrophomonas maltophilia가 분비하는 세포 외 용균성 효소인 protease를 이용하여 모잘록병을 일으키는 Pythium ultimum 같은 병원성 진균에 항진균 활성을 보였다고 보고하였다.
이상의 결과로서 B. amyloliquefaciens HY는 PGP 활성과 protease 생성능을 나타내어 상추 균핵병균에 대한 PGPR의 역할을 하고 항진균적 활성을 나타내는 것으로 판단된다.
상추 균핵병에 대한 길항세균의 방제 효과 검정
B. amyloliquefaciens HY의 상추 균핵병에 대해 길항 효과 검정을 위해 서울시립대학교 온실 내에서 2021년 3월에서 4월에 걸쳐 실험을 수행한 결과, 상추 균핵병균의 접종 후 4일째부터 가시적인 시들음 증상이 나타나기 시작하여 30일 후 40%의 발병률로 균핵병이 발병하였다. 무처리구에서 상추 생존율은 95%를 나타냈고(Fig. 6A), 병원균만 처리한 대조구에서는 60%의 상추 생존율을 나타냈다(Fig. 6B). 상추 균핵병균과 길항세균을 동시 처리한 처리구에서는 길항세균 현탁배양액을 50배 희석한 처리구에서 80%의 상추 생존율을 보여 희석처리구 중 상대적으로 높은 상추의 생존율을 보였고(Fig. 6E), 상추 균핵병균을 먼저 처리하고 1주 후에 길항세균 배양액을 처리한 처리구에서는 100배 희석 처리구에서 85% (Fig. 6H)로 가장 높은 생존율을 나타냈다(Table 4, Fig. 6).
Fig. 6.
Survival rate of sclerotinia rot of lettuce as drenching Bacillus amyloliquefaciens HY against Sclerotinia sclerotiorum in greenhouse (A-J). Untreated control (A) and pathogen treatment (B). Ten-fold bacterial dilution treatment (C, D). Fifty-fold bacterial dilution treatment (E, F). One hundred-fold bacterial dilution treatment (G, H). Fungicide (fludioxonil SC) treatment (I, J). Simultaneous treatment of S. sclerotiorum and B. amyloliquefaciens HY or fungicide (C, E, G, I). B. amyloliquefaciens HY or fungicide treatment 1 week after inoculation of S. sclerotiorum (D, F, H, J).
Table 4.
Survival rate of Sclerotinia rot of lettuce as drenching treatment of Bacillus amyloliquefaciens HY against Sclerotinia sclerotiorum at 30 days after inoculation in greenhouse
| Treatment | Survival rate of lettuce (%)a,b | |
|---|---|---|
| Same timec | 1 week later | |
| Control (water) | 95 | |
| S. sclerotiorum | 60 | |
| B. amyloliquefaciens HY (×10) | 65 | 80 |
| B. amyloliquefaciens HY (×50) | 80 | 70 |
| B. amyloliquefaciens HY (×100) | 55 | 85 |
| Fludioxonil SC | 100 | 70 |
본 연구에서 기내 조건일 때 B. amyloliquefaciens HY 균주가 대치배양 실험에서의 균사 생장 억제능, 휘발성 실험에 의한 균사 생장 억제능, 균핵 발아 억제능을 확인하였고, 균사의 형태학적인 변화를 초래한 것으로 보아 상추 균핵병균인 상추 균핵병균에 대한 항진균 활성이 확인되었으나 온실 내에서 상추를 이용한 균핵병 방제 실험에서 뚜렷한 방제가를 나타내지 못했다. 실험 기간의 온실 내 온도는 HOBO temperature logger (Onset Computer Corporation, Bourne, MA, USA)로 측정한 결과 일평균 온도 23.6°C, 최고 온도 46.4°C, 최저 온도 8.7°C로 평균 온도는 균핵병의 발병 조건과 적합했으나 일교차가 큰 특징을 보였고, 상대습도는 평균 50.2%, 최저습도 15.2%, 최고습도 86.5%로 나타났다.
B. amyloliquefaciens HY의 상추 균핵병에 대해 길항 효과 검정을 위해 서울시립대학교 생육상(growth chamber) 내에서 2021년 6월에서 7월에 걸쳐 실험을 수행한 결과, 상추 균핵병균의 접종 후 3일째부터 가시적인 시들음 증상이 나타나기 시작하여 약 30일 후 100%의 발병률로 균핵병이 발병하였다. 무처리구에서 상추 생존율은 100%를 나타냈고(Table 5, Fig. 7A), 병원균만 처리한 대조구에서는 0%의 상추 생존율을 나타냈다(Table 5, Fig. 7B). 상추 균핵병균과 길항세균을 동시 처리한 처리구에서는 길항세균 현탁배양액을 10배 희석한 처리구에서 80%의 상추 생존율을 보여 희석처리구 중 상대적으로 높은 상추의 생존율을 보였고(Table 5, Fig. 7C), 50배 처리구에서는 60%의 상추 생존율(Table 5, Fig. 7E), 100배 처리구에서는 30%의 상추 생존율을 나타냈다(Table 5, Fig. 7G). 상추 균핵병균을 먼저 접종하고 1주 후에 길항세균 배양액을 처리한 처리구에서는 50배 희석 처리구에서 80%로 가장 높은 생존율을 나타냈고(Table 5, Fig. 7F), 100배 처리구에서 70%의 생존율을 보였고(Table 5, Fig. 7H), 10배 처리구에서는 60%의 생존율을 나타냈다(Table 5, Fig. 7D). 플루디옥소닐 액상수화제는 균핵병균 접종과 동시에 관주 처리한 경우 100% 상추 생존율(Table 5, Fig. 7I)을 나타냈고, 균핵병균 처리 1주일 후 관주 처리한 경우 70% 상추 생존율(Table 5, Fig. 7J)을 나타냈다.
Fig. 7.
Survival rate of sclerotinia rot of lettuce as drenching Bacillus amyloliquefaciens HY against Sclerotinia sclerotiorum in growth chamber (A-J). Untreated control (A) and pathogen treatment (B). Ten-fold bacterial dilution treatment (C, D). Fifty-fold bacterial dilution treatment (E, F). One hundred-fold bacterial dilution treatment (G, H). Fungicide (fludioxonil SC) treatment (I, J). Simultaneous treatment of S. sclerotiorum and B. amyloliquefaciens HY or fungicide (C, E, G, I). B. amyloliquefaciens HY or fungicide treatment 1 week after inoculation of S. sclerotiorum (D, F, H, J).
Table 5.
Survival rate of Sclerotinia rot of lettuce as drenching treatment of Bacillus amyloliquefaciens HY against Sclerotinia sclerotiorum at 30 days after inoculation in growth chamber
| Treatment | Survival rate of lettuce (%)a,b | |
|---|---|---|
| Same timec | 1 week later | |
| Control (water) | 100 | |
| S. sclerotiorum | 0 | |
| B. amyloliquefaciens HY (×10) | 80 | 60 |
| B. amyloliquefaciens HY (×50) | 60 | 80 |
| B. amyloliquefaciens HY (×100) | 30 | 70 |
| Fludioxonil SC | 100 | 70 |
이러한 결과를 통해 상추 균핵병에 대한 방제 효과를 확인하기 위해 B. amyloliquefaciens HY를 상추에 처리했을 때 상추 균핵병균만 접종한 대조구의 상추가 모두 고사한 것과 비교하여 B. amyloliquefaciens HY를 처리한 처리구에서 30-80%까지의 상추 생존율을 나타내는 것으로 보아 상추 균핵병에 대해 길항 효과를 보이는 것으로 판단된다.
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