*Corresponding authors H. Chung 서 론
벼(Oryza sativa L.)는 세계 인구의 절반이 주식으로 삼는 중요한 작물이다(Bandumula, 2018). 따라서 벼 생산량의 감소는 쌀을 주식으로 하는 아시아 지역에 심각한 위협이 될 수 있다. 벼에 발생하는 병원균은 70종 이상으로 알려져 있으며(Saha 등, 2015), 높은 온도를 선호하는 Burkholderia glumea(세균성 벼알마름병), Rhizoctonia solani(벼 잎집무늬마름병), Bipolaris oryzae(벼 깨씨무늬병)와 같은 병원균들은 최적 성장 온도 범위가 비교적 높다. 이러한 병원균들은 최근의 세계적인 온난화 현상으로 인해 기온이 상승할 경우(Guan, 2009), 안정적인 식량 생산에 큰 문제를 초래할 가능성이 있다(Ham 등, 2011; Savary 등, 2011).
이 중 Bipolaris oryzae (= Helminthosporium oryzae; teleomorph = Cochliobolus miyabeanus)는 벼 및 화본과 작물에 깨씨무늬병(brown spot disease)을 일으키는 병원균으로, 벼의 전 생육기에 걸쳐 발생하는 병원균이다(Sunder 등, 2014). 벼 깨씨무늬병이 유묘기에 발생할 경우 전체 광합성 면적에 영향을 미쳐 벼의 품질과 낱알의 중량을 감소시킨다(International Rice Research Institute, 2022). 국제미작연구소(International Rice Research Institute, 2022)의 보고에 따르면, 벼 깨씨무늬병은 벼의 전 생육기에 나타나 수확량 감소가 5-45%까지 발생할 수 있다고 보고한다(Choudhury 등, 2019; Estrada, 1984; Padmanabhan, 1973; Webster와 Gunnell, 1992). 방글라데시에서는 18.8-22.5%의 수확량 감소가 보고되었으며(Kamal과 Mia, 2009), 인도에서 4-52%에 이르는 수확량 손실도 보고되었다(Barnwal 등, 2013).
잠재적 문제성 곰팡이 병원균인 깨씨무늬병을 방제하기 위한 가장 효과적인 방법은 저항성 벼의 육종으로 알려져 있다(Sunder 등, 2014). 저항성 벼를 육종하기 위해서는 병이 발생한 포장에서 분리된 병원균의 다양한 특성을 연구해야 하며, 이러한 연구를 위해서는 단포자 분리를 통한 균주의 확보, 병원균의 집단 유전 분석, 효과적인 병 방제법 개발, 기주식물의 병 저항성 검정 등 포자 확보가 매우 중요한 요소이다. 확보된 포자는 병원균의 정량적 계수를 통해 실험에 사용되며, 포자 확보가 어려울 경우 연구 진행이 원활하지 않다(Agrios, 2005; Dhingra와 Sinclair, 1995).
벼 깨씨무늬병균(B. oryzae)은 인공 배지를 통한 기내에서의 포자 확보가 어려운 병원균으로 알려져 있으며, 포자 형성에는 특수한 광 조건과 영양 조건이 필요하다고 보고되었다(Sunder 등, 2014). B. oryzae의 포자 형성에는 명과 암 상태가 모두 필요하며, 근자외선(near-ultraviolet, NUV)에 의해 자극받고 청색광에 의해 억제된다고 보고하였다(Ou, 1985).
B. oryzae의 포자 확보를 위한 포자 형성 조건에 대한 연구가 진행되어 왔으며, (1) 다양한 환경(광 조건) 및 영양 조건(인공 배지 및 천연 배지)에 관한 연구가 집중적으로 이루어졌다(Hau와 Rush, 1980; Leach, 1961). 그러나 최근까지도 안정적이고 지속적으로 포자를 확보할 수 있는 조건을 찾기 위한 연구가 계속되고 있을 만큼, 포자 형성이 어려운 병원균이다(Basavaraj 등, 2023).
Hau와 Rush (1980)의 보고에 따르면, 블랙 라이트(black light)와 암 상태를 12시간씩 교대하는 주기로 상업적으로 판매되는 토끼 사료 한천 배지(rabbit food agar media)에서 총 15일간 배양하였을 때 가장 많은 수의 포자가 형성된다고 보고하였다. 그러나 블랙 라이트만 지속적으로 조사하거나 혹은 암 상태만을 유지하였을 경우에는 포자가 형성되지 않는다고 보고하였다. 이외에도 최적의 포자 형성을 위해 만노스, 전분, 자당 등 다양한 영양분을 이용한 연구가 보고되었다(Kulkarni 등, 1980).
Basavaraj 등(2023)의 보고에서도 Hau와 Rush (1980)와 유사한 조건에서 가장 효과적인 포자가 확보된다고 보고하였다. 이들은 두 개의 균주를 사용하여 근자외선(NUV), 자외선, 가시광선의 3가지 광 조건을 이용한 다양한 조합의 광 조사가 미치는 영향을 검정하였다. 이 보고에서는 토끼 사료 한천 배지에서 5일간 암 배양한 후, 12시간 동안 근자외선(NUV)과 암 상태 배양을 12시간씩 교대로 조사하였을 때 가장 많은 수의 포자가 확보되었다고 보고하였다. 또한, 이 연구에서 추가적으로 감자포도당 한천 배지(potato dextrose agar [PDA] media)의 영양분 농도를 100%, 50%, 25%, 10%, 0%로 세분화하여 포자 형성을 살펴본 결과, 10% PDA에서 가장 많은 수의 포자가 형성되었다고 보고하였다.
이와 같이 B. oryzae의 포자 형성을 위한 다양한 시도와 연구 보고에도 불구하고, B. oryzae의 포자 형성을 위한 최적 조건은 아직까지 표준화되지 않았다. 본 연구는 2023년 우리나라의 포장에서 수집한 균주를 이용하여 안정적인 포자 확보를 위해 (1) 광 조건과 (2) 배지 조건을 탐색하고 최적화하는 기초 자료를 확보하고자 수행되었다.
재료 및 방법
균주 및 배양 조건
벼 깨씨무늬병 균주는 2023년 전라북도 군산(35°91’72” N, 126°78’72” E)과 경상남도 고성(34°98’03” N, 128°33’38” E)에서 각각 분리한 B. oryzae CM23-042 균주와 23CM10 균주를 국립식량과학원 작물기초기반과에서 분양받았다.
CM23-042 균주는 볍씨에서 23CM10 균주는 잎에 발생한 벼 깨씨무늬 병반으로부터 각각 분리한 균주였다. 균주는 실험 과정 동안 균주의 유지 및 보관을 위해 PDA 배지(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)를 사용하여 배양하였다. 균주의 장기 보존을 위해 2주간 배양된 균주의 균사 블럭을 7×7 mm 크기로 잘라 멸균된 20% glycerol 용액에 넣어 3일간 25°C에서 배양한 뒤, −80°C 초저온 냉동고에 보관하였다.
염기서열 분석
Nuclear rDNA internal transcribed spacers (ITS) 부분을 ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)와 ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) 프라이머를 사용하여 증폭하였다(White 등, 1990). Polymerase chain reaction (PCR)은 ABI 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 확보된 PCR 산물은 동일한 프라이머를 사용하여 염기서열 분석을 진행하였다. 확보된 염기 서열은 SeqMan (DNA Star Lasergene, version 7.1; DNA STAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 편집하였으며, 이 서열은 NCBI의 Basic Lo-cal Alignment Search Tool (BLAST; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통해 분석하였다. 확보된 염기서열 정보는 National Center for Biotechnology Information (NCBI)에 제출하여 accession number를 확보하였다.
광 조건에 따른 포자 형성
포자 유도를 위한 광 조건은 두 가지로 나누어 진행하였다: 1) 근자외선등(NUV, 405 nm, 7.2 W 램프; Greenmax Electric Corporation, Incheon, Korea)과 형광등(FHF 32WWSSEX-D-HS, 82.6 lm/W, 32 W; Kumho Electric Corporation, Seoul, Korea)을 24시간 지속적으로 조사하는 방법, 2) 근자외선등을 12시간 동안 조사한 후 연이어 암 상태에서 12시간 유지하는 방법으로, 이 사이클을 반복하였다. 광 조건 실험에서는 PDA 배지를 기본 배지로 사용하였다.
지속적으로 포자 형성 빈도를 현미경으로 관찰하기 위해 슬라이드 배양법(slide culture method)을 이용하였다. 슬라이드 배양법을 간략히 설명하면 다음과 같다. 90×15 mm 크기의 Petri-dish (10090; SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)에 15 ml의 PDA 배지를 부어 고체화한 후, 정사각형(가로×세로=10×10 mm)으로 잘랐다. 멸균된 슬라이드 글라스 위에 정사각형으로 자른 PDA 배지를 옮긴 후, 균주를 사방으로 이쑤시개를 이용하여 1주일 동안 암 상태에서 배양된 균사를 접종하였다. 접종이 완료된 슬라이드 글라스는 멸균된 페이퍼 타올 위에 놓고, 멸균 증류수 8 ml를 포함한 9 cm petri-dish로 옮겨 상대 습도가 90% 이상이 되도록 밀봉하였다. 이후 두 가지 서로 다른 광 조건으로 옮겨 7일간 배양하였다. NUV 는 petri-dish 위쪽 30 cm 떨어진 곳에 설치하였으며, 형광등은 45 cm 높이에 설치하여 조사하였다. 배양 온도는 25°C로 유지하였다.
실험 7일 후 정사각형으로 배양된 배양체의 각 4면에서 말단 3부분(실험적 반복)을 무작위로 선정하여 Zeiss Axio Imager A1 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 60배(대물렌즈 6×, 접안렌즈 10×)로 관찰하였다. 총 3회의 생물학적인 반복 실험을 수행하였다.
배지 조건에 따른 포자 형성
배지에 따른 포자 형성의 차이를 검정하기 위해 총 7가지의 배지를 사용하였다: (1) PDA(앞서 기술한 동일 배지 사용); (2) V8-Juice 한천 배지(V8) (8% Camp-bell's V8-Juice [Cambell Soup Co., Camden, NJ, USA], 1.5% agar [w/v], 0.1 N NaOH로 pH 7.0으로 조정); (3) 최소 배지(minimal medium [MM]) 멸균 증류수 1 l당 다음을 포함: glucose, 10 g; NaNO3, 6 g; KCl, 0.5 g; MgSO4·7H2O, 0.5 g; KH2 PO4, 1.5 g; agar 15 g; 미량원소 용액(멸균 증류수 95 ml에 다음을 포함: citric acid, 5 g; ZnSO4.7H2O, 5 g; Fe(NH4) 2 (SO4)2.6H2O, 1 g; CuSO4.5H2O, 0.25 g; MnSO4·H2O, 0.25 g; H3 BO3, 50 mg; Na2 MoO4.2H2O, 50 mg) (Correll 등, 1987), 1 ml; 비타민 용액(50% ethanol 용액 1 l에 다음을 포함: thiamine·HCl, 100 mg; riboflavin, 30 mg; pyridoxine·HCl, 75 mg; D-panthothenate·Ca, 200 mg; p-aminobenzoic acid, 5 mg; nicotinamide, 75 mg; choline [Cl], 200 mg; forlic acid, 5 mg; D-biotin, 5 mg; and myo-inositol, 4 g) (Talbot 등, 1993), 1 ml; (4) sucrose-proline 한천 배지(sucrose-proline agar, SPA) 멸균 증류수 1 l당 다음을 포함: sucrose, 6 g; proline, 2.7 g; K2 HPO4, 1.3 g; KH2 PO4, 1 g; KCl, 0.5 g; MgSO4·7H2O, 0.5 g; FeSO4, 10 mg; ZnSO4, 2 mg; MnCl2, 1.6 mg; agar, 20 g (Shoemaker, 1962); (5) rabbit food 한천 배지(rabbit food agar, RFA) 상업적으로 판매되는 rabbit food (Genesis ultra-extruded timothy; Morrell Pet Products, Dur-ham, Canada), 50 g; agar, 20g; pH 6.5 (Hau와 Rush, 1980); (6) 쌀겨 한천 배지(rice bran agar, RBA) 멸균 증류수 1 l당 다음을 포함: rice bran, 20 g; sucrose, 6 g; agar, 20 g; (7) rice leaf 한천 배지(rice leaf agar, RLA) 1.5% 한천 배지 조제 후 멸균된 벼 잎(5×5 mm) 5조각.
배지 조제 후, 앞선 실험과 동일한 슬라이드 배양법 방법을 적용하여 실험을 수행하였다. 본 연구 결과로 밝혀진 NUV와 형광등의 24시간 조사 방법을 7가지 배지 선정 실험에 동일하게 적용하였다. 앞선 실험과는 달리, 배양 후 3일, 5일, 7일 결과 시 포자 형성 여부와 포자 수를 현미경을 통해 검정하였다. 실험은 총 4회의 실험적 반복과 3회의 생물학적 반복 실험을 수행하였다.
결과 및 고찰
B. oryzae 포자 유도 광 조건
실험에 사용한 두 개의 B. oryzae 균주, CM23-042와 23CM10의 ITS 염기서열(GenBank accession numbers: PQ169652∼PQ169653)은 균주 B. oryzae CBS 199.54 (MH857291)와 100%의 상동성(577/577 bp)을 보였다. 이 두 균주는 실험의 공시 균주로 사용되었다. 벼 깨씨무늬병균 CM23-042 균주는 첫 번째 광 조건인 NUV와 형광등을 지속적으로 조사했을 때만 포자가 형성되었다(Fig. 1A 왼쪽). 반면, 23CM10 균주는 두 가지의 광 조건 모두에서 포자가 형성되었으나(Fig. 1A 오른쪽), 첫 번째 광 조건인 NUV와 형광등을 지속적으로 조사한 조건에서 13배 더 많은 포자가 형성되었다. 이 결과는 광 조건이 B. oryzae의 포자 형성과 매우 밀접한 관련이 있음을 시사한다. 또한, 23CM10 균주가 CM23-042 균주에 비해 동일한 광 조건에서도 5배 이상의 포자를 형성하였으며, 이는 균주 간 포자 형성 능력에 차이가 있음을 나타낸다.
Fig. 1.
Conidial formation of two Bipolaris oryzae isolates, CM23-042 and 23CM10, under the two light treatments examined. (A) The upper left and right images display conidiation after exposure to constant near-ultraviolet (NUV) and fluorescent light for 24 hr. The lower left and right images show the condition after exposure to NUV light and a dark cycle for 12 hr each. The photographs were captured 7 days post-inoculation on potato dextrose agar (PDA) medium. (B) A comparison of conidial production under the two different light conditions. Conidiation was quantified by counting the number of conidia from the slide culture. The aster-isk (*) denotes that means with different letters are significantly different, as determined by Duncan's multiple range test (P=0.05).
B. oryzae 포자 유도 배지 조건
B. oryzae CM23-042 균주를 본 연구에서 제시한 포자 유도 광 조건(NUV와 형광등의 24시간 조사) 하에 7일간 배양한 결과, MM에서 가장 많은 포자가 형성되었다(Fig. 2B 왼쪽). 그 다음으로 V8, PDA, RFA, RLA 순으로 포자가 형성되었다(Fig. 2B 왼쪽). 그러나 SPA와 RBA에서는 전혀 포자가 관찰되지 않았다.
Fig. 2.
Conidial formation of two Bipolaris oryzae isolates, CM23-042 and 23CM10, under seven different media. (A) Conidial production of the isolates, CM23-042 and 23CM10. Conidiation was quantified by counting the number of conidia from the slide culture. The red arrow-heads point to the formation of a conidium on the conidiophore. The photographs were captured 7 days post-inoculation (dpi) on potato dextrose agar (PDA) medium. (B) The image shows conidial formation in PDA, V8-Juice agar, minimal medium (MM), sucrose-proline agar (SPA), rabbit food agar (RFA), rice bran agar (RBA), and rice leaf agar (RLA). Duncan's multiple range test was employed to determine sig-nificance at the 95% probability level. Identical letters for each dpi (3, 5, and 7 dpi) indicate no significant difference.
B. oryzae CM23-042 균주의 접종 3일차에 MM에서만 포자가 관찰되었다(Fig. 2B 왼쪽). 배양 5일차에는 3일차와 마찬가지로 MM에서 가장 많은 포자 수(10.7±3.8)가 관찰되었으며, 그 뒤로 PDA (5.0±2.6), RFA (2.0±1.0), V8 (1.7±1.2) 순으로 포자 형성이 관찰되었다. 접종 7일차에도 앞선 결과와 유사하게 MM에서 가장 많은 포자 수(14.0±1.7)가 형성되었으며, 통계학적으로 유의미한 수준에서 다른 배지에서 형성된 포자 수와 차이가 있었다. 그 뒤로 PDA (5.7±3.5), V8 (6.3±2.1), RFA (5.3±1.5), RLA (5.0±1.7) 순으로 포자가 형성되었으며, 이들 4개 배지에서의 포자 형성 수는 통계학적으로 동일한 수준이었다(Fig. 2A, B 왼쪽). 또한 B. oryzae CM23-042 균주는 SPA와 RBA 배지에서 7일 동안 배양하였을 때 포자가 관찰되지 않았다.
B. oryzae 23CM10 균주는 7일간 배양하였을 때 CM23-042 균주와 비교하여 상대적으로 많은 수의 포자 형성이 관찰되었다. 23CM10 균주는 PDA, MM, SPA, RFA 배지에서 V8, RLA보다도 더 많은 포자를 형성하였다. 그러나 RBA 배지에서는 전혀 포자가 관찰되지 않았다(Fig. 2A 오른쪽).
B. oryzae 23CM10 균주는 접종 3일차 MM 배지에서 포자 수 26.3±10.6과 SPA 배지에서 포자 수 24.0±24.0로 통계적으로 동일한 수준으로 가장 많은 포자가 형성되었으며, 그 다음으로 PDA (10.0±10.0), RFA (11.0±11.0) 배지에서 통계학적으로 유사한 수준으로 포자가 형성되었다. 그러나 V8, RBA, RLA 배지에서는 포자가 형성되지 않았다(Fig. 2B 오른쪽).
5일 후 포자 형성 관찰 결과, RBA (0.0±0.0) 배지를 제외한 모든 배지에서 포자 형성이 확인되었다. B. oryzae 23CM10 균주는 RFA (46.7±14.6), PDA (44.0±14.4), SPA (39.3±19.0) 배지에서 통계적으로 동일한 수준으로 포자가 형성되었으며, 그 뒤를 이어 MM (29.0±6.6), V8 (12.0±11.3) 배지에서 통계적으로 동일한 수준으로 포자 형성이 관찰되었다. 그러나 RLA (3.0±2.0) 배지에서는 포자가 드물게 관찰되었으며, RBA (0.00.0) 배지에서는 포자 형성이 전혀 관찰되지 않았다(Fig. 2B 오른쪽).
B. oryzae 23CM10 균주의 7일차 포자 형성 관찰 결과, 5일차와 달리 PDA (73.7±13.1)에서 가장 많은 포자가 형성되었으며, 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 그 다음으로 RFA (48.3±14.2), SPA (47.7±16.3), MM (35.3±10.6) 배지에서 포자가 통계적으로 유사한 수준으로 형성되었다. 또한 V8 (13.3±2.3)과 RLA (9.7±1.2) 배지는 앞선 배지들과 비교하여 포자 형성이 현저히 낮았다. B. oryzae CM23-042 균주와 마찬가지로, 23CM10 균주에서도 RBA (0.0±0.0) 배지에서는 포자가 형성되지 않았다(Fig. 2A, B 왼쪽).
이전 연구 보고에서는 본 연구에서 사용한 두 번째 조건인 빛 조건, 즉 12시간씩 교대로 NUV와 암흑 상태로 조사하였을 때 가장 많은 수의 포자가 형성된다고 보고하였으나(Basavaraj 등, 2023; Kulkarni 등, 1980; Leach, 1961), 본 연구 결과에서는 NUV 와 형광등을 지속적으로 조사하였을 때 포자 형성이 더 효과적임을 확인하였다. 특히 실험에 사용한 두 개의 균주 중 23CM10은 실험 수행 7일 후 다른 균주인 CM23-042에 비해 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 이 포자 형성 결과의 차이는 다양한 요인에 의해 발생할 수 있다. 예를 들어, (1) 실험에 사용한 NUV 또는 형광등과 같은 빛의 차이(광도 또는 광질), (2) 기존 연구에서 사용한 균주와 본 연구에서 사용한 균주의 차이 또는 (3) 실험 검정 방법의 차이 등이 있을 수 있다.
지금까지 보고된 연구 결과를 살펴보면, 포자 형성의 가능성을 높이는 방법 개발에 관한 연구가 진행되어 왔다. 이 연구에서는 한 개의 균주(Hau와 Rush, 1980) 또는 두 개의 균주(Basavaraj 등, 2023)를 대표 균주로 사용하여 다양한 빛과 영양분 배지 조성에 관한 연구가 이루어졌다. 따라서 많은 수의 포장에서 채집된 균주들에 대한 검증이 필요할 것이다. 그 이유는 본 연구에서도 밝혀진 바와 같이 두 개의 공시 균주(CM23-042와 23CM10)에서 빛과 영양분에 대한 반응이 매우 다르다는 점이다(Figs. 1, 2).
이전 연구 결과에 따르면, 토끼 풀 펠렛이 사용된 RFA 배지가 PDA보다도 더 많은 포자를 형성한다고 보고되었으나(Basavaraj 등, 2023; Hau와 Rush, 1980), 우리의 연구에서는 이전 연구와 달리 CM23-042 균주가 영양분이 최소로 첨가된 최소 배지인 MM 배지에서 가장 많은 수의 포자를 형성한 것으로 나타났다. 반면, 23CM10 균주는 영양분이 상대적으로 높은 PDA 배지에서 통계적으로 유의미한 차이를 보였다. 이러한 불일치는 균주 간의 극명한 특성의 차이 때문일 수 있으며, B. oryzae 의 포자 형성 메커니즘은 앞으로 밝혀져야 할 중요한 과제이다. Basavaraj 등(2023)의 연구에서도 실험에 사용된 두 개의 균주가 PDA의 영양 함량을 순차적으로 줄였을 때, 10%의 PDA 배지를 포함한 한천 배지에서 가장 많은 수의 포자가 형성된다고 보고하였다. 이 연구에서는 10% 감자 포도당 배지가 100% 배지보다 26-37% 더 많은 포자를 형성했다고 밝혔다. 벼 깨씨무늬병이 영양 결핍 토양에서 발생할 확률이 높은 것도 포자 형성에 대한 합리적인 추론으로 볼 수 있다(Ou, 1985). 본 연구 결과에서도 CM23-042 균주는 MM에서 가장 많은 포자를 형성하였으며, 23CM10 균주는 MM에서 PDA보다 적게 형성되었으나 두 번째 순위 그룹(RFA, SPA, MM)에 포함되어 이러한 추론을 뒷받침한다.
한국에서 수집된 다수의 B. oryzae의 안정적인 포자를 확보하기 위해, 이 연구 결과에서 제시된 조건들을 바탕으로 각 영양 배지의 함량을 순차적으로 줄여 최소 배지 함량 상태로 조정한다면 안정적인 포자 확보가 가능할 것이다. 본 연구는 앞으로 지구 온난화에 따라 돌발적으로 발생하여 피해를 줄 가능성이 높은 벼 깨씨무늬병의 특성 연구를 위한 포자 확보의 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
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