시료 채집

국내 맥류에 발생하는 곰팡이 병 발생 실태를 조사하기 위해 2020년과 2021년 맥류의 분얼기와 신장기인 3-4월에 남부 지역 맥류 재배지에서 곰팡이 병을 육안 관찰을 통해 병 발생 양상을 조사하였다. 2020년 전라남도 강진, 해남 지역의 보리, 밀, 귀리 재배지를 조사하였고, 2021년은 전라남도 순천, 보성, 장흥과 경상남도 사천 및 고성을 조사하였다(Fig. 1A). 병 조사는 곰팡이 병이 발생한 지제부와 잎을 중심으로 조사하였다.

Fig. 1.

Collection map of disease survey areas and the number of collected isolates from barley, wheat, and oats in the southern part of South Korea from 2020 to 2021. (A) The map in the upper left square is of South Korea. The enlarged map shows the area where the survey was conducted, providing a close-up view of the blue circle area in the upper left corner of the map. The green and red spots indicate survey areas in 2020 and 2021, respectively. (B) The distribution of the collected isolates among 92 samples from seven different survey areas in the southern part of Korea. (C) Typical sharp eyespot symptoms on cereals.

병원균 분리

채집된 시료는 건전 부위와 병 감염 부위의 경계 부위를 5×5 mm로 자른 뒤, 100% ethanol에서 1분, 1% NaOCl 용액에서 1분간 표면 살균하였다. 이후 멸균 증류수를 이용하여 3회 씻어준 뒤 표면 물기를 제거하였다. 표면 살균된 시료는 streptomycin (100 µg/ml)이 첨가된 1.5% 물 한천 배지(15 g agar/l)에 치상하여 25°C 항온기에서 7일간 암 상태로 배양하였다. 배양체에서 자라 나온 균사의 선단부를 떼어 새로운 감자 한천 배지(potato dextrose agar [PDA] media; BD Difco, Sparks, MD, USA)로 옮겨 동일한 조건에서 14일간 배양하였다.

순수 배양을 위해 포자가 형성된 곰팡이의 경우 단포자를 분리하였으며, 포자가 형성되지 않은 경우는 균사 선단부의 말단 균사 분리를 통해 단균사 분리를 수행하였다. 장기보존은 순수 분리 배양된 포자 또는 균사를 2 ml sterile cryo-vials (Cryo.s 2 ml; Greiner bio-one, Kremsmuster, Austria)에 넣은 뒤 15% glycerol 용액을 첨가하여 3일간 상온에 두었다가 −80°C에 보관하였다.

형태학적 특성 검정

분리된 곰팡이 균주의 형태적 관찰을 위해 PDA 배지 중앙에 접종하여 25°C 항온기에서 암 상태로 배양하여 빠르게 자라는 병원균의 경우 7일, 느리게 자라는 병원균의 경우는 21일간 배양한 뒤 균총 모양 및 배양체의 앞과 뒷면의 색을 관찰하였다. 포자의 형성 유무, 모양과 크기는 광학현미경 Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 통해 관찰하였다. 추가적으로 곰팡이 염색은 lactophenol cotton blue 용액(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 5분간 처리하여 현미경 관찰하였다.

DNA 추출 및 염기서열 분석

맥류의 분자생물학적인 동정을 위해 분리된 병원균으로부터 DNA를 추출하였다. Genomic DNA의 추출은 NucleoSpin^® Plant II kit (Macherey Nagel, Du-ren, Germany)를 이용하여 추출하였다. 추출된 DNA는 polymerase chain reaction (PCR) 증폭에 사용하였다.

모든 분리된 곰팡이 병원균은 분자생물학적 동정을 위해 internal transcribed spacer (ITS) 영역을 증폭하여 동정하였다. ITS 영역의 증폭을 위해 사용된 primer는 ITS1F(5’-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3’) (Gardes와 Bruns, 1993)와 ITS4(5’-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3’) (White 등, 1990) 한 쌍을 사용하였다. PCR 반응을 위해 tube에 genomic DNA 25 ng, primer ITS1F (10 pmol/µl)와 ITS4 (10 pmol/µl)를 각각 1 μ l씩 사용하였으며, 2× PCR Master Mix Solution (i-MAXII; iNtRON Biotechnology, Sungnam, Korea)을 10 μ l 그리고 나머지 멸균 증류수를 넣어 총 용량 20 μ l가 되도록 준비하였다. PCR 수행 조건은 초기 94°C에서 5분 반응시킨 뒤, 94°C에서 30초, 52°C에서 1분, 72°C에서 1분 과정을 30회 수행한 뒤, 마지막 72°C에서 5분 반응하였다. PCR 증폭 산물의 유무는 0.8% agarose gel에서 100 volt로 30분간 전기영동한 뒤, UV 하에서 PCR 산물의 유무를 확인하였다. 증폭 산물의 염기서열 분석은 바이오니어(Bioneer, Dae-jeon, Korea)에 의뢰하여 확보하였다.

염기서열은 SeqMan (DNAStar Lasergene, version 7.1; DNA-STAR, Madison, WI, USA)을 이용하여 염기서열의 정렬 및 편집하여 확보하였다. 확보된 염기서열은 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment search Tool (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 검색을 통해 상동성이 높은 균주 정보와 비교하여 가장 높은 상동성을 보이는 정보를 확보하여 학명에 관한 정보를 확보하였다. 모든 확보된 염기서열 정보는 NCBI에 deposit하여 accession number를 확보하였다(Table 1).

Table 1.

List of collected isolates, collected regions, species, and GenBank accession numbers for ITS region sequences

곰팡이 병 조사 및 시료 확보

2020-2021년 3-4월 동안 남부 지역에서 재배된 보리, 귀리, 밀을 포함하는 맥류에 발생하는 곰팡이 병을 조사하였다. 조사 기간 동안은 출수하기 전과 출수 이후의 맥류가 포함되어 있어 병 조사는 주로 잎과 지제부에 국한하여 진행되었다. 2020년 곰팡이 조사의 경우 전라남도 해남과 강진의 귀리 재배지를 중심으로 맥류의 곰팡이 병 조사가 이루어졌으며, 2021년은 더 확대하여 전라남도 4개 지역(강진, 장흥, 보성, 순천)과 경상남도 2개 지역(사천과 고성)에서 재배되는 보리, 밀 및 귀리에서 발생하는 곰팡이 병 조사를 수행하였다(Fig. 1A).

2020년 곰팡이 병 시료 수집을 통해 총 32개의 균주를 분리하였다. 보리, 밀, 귀리에서 관찰된 곰팡이 병징으로부터 각각 6개, 9개 및 17개 시료를 각각 수집 및 병원균 분리를 수행하였다(Fig. 1B). 2021년의 경우 보리, 밀, 귀리로부터 각각 35개, 19개, 6개 시료를 수집·분리하였다(Fig. 1B). 이를 통해 총 92개의 균주를 확보하였다.

조사 기간 동안 보리, 밀과 귀리를 포함한 맥류에서 가장 높은 빈도로 관찰된 병징은 지제부에서 관찰된 잎집눈무늬병(sharp eyespot) 증상이었다(Fig. 1C). 보리, 밀과 귀리 모두 동일하게 높은 빈도로 관찰되었으며 무작위적으로 선택하여 관찰한 총 개체의 2-5% 범위 내에서 병징이 관찰되었다. 병징은 Fig. 1C와 같이 지제부의 맥류 잎집에 초반에는 눈무늬로 관찰되었으며, 병이 진전됨에 따라 날카로운 눈무늬가 타원형으로 확대되면서 주변의 다른 잎집눈무늬 병반과 합쳐지며 심할 경우 잎까지 진전되기도 하였다. 병반 가장자리는 갈색 또는 암갈색이었으며, 가장자리의 안쪽은 하얗게 변하며 회백색을 띄기도 하였다(Fig. 1C).

맥류에서 수집한 곰팡이 병 균주의 형태학적 동정

분리된 균주의 배양적 특성, 균사 격막의 유무 그리고 포자가 관찰될 경우 포자의 형태를 통해 병원균의 형태학적 동정을 수행하였다. 수집 균주들의 배양적 특성은 PDA 배지에서 2주에서 4주간 배양하여 culture-dish 앞면의 균사의 특성과 색을 살펴보았으며, 뒷면도 마찬가지로 색소(pigment)의 집적 등의 특성을 살펴보았다. 기술된 배양적 특성을 통해 분류한 뒤, 대표성을 띄는 균주들의 현미경적 관찰을 수행하였다.

맥류(보리, 밀, 귀리)의 잎집눈무늬병(sharp eyespot disease)의 병징(Fig. 2A 왼쪽)으로부터 분리된 균주의 경우 균사는 흰색에서 크림색이었으며(Fig. 2A 중앙), 현미경으로 관찰한 결과 균사가 직각 분지하는 특성이 관찰되었다(Fig. 2A 오른쪽). 그러나 4-8주 배양 기간 동안 포자는 관찰되지 않았다. 관찰한 특성을 고려하여 Ceratobasidium 속 균으로 동정하였다.

Fig. 2.

Morphological characteristics of six dominant representative species. (A-F) Naturally occurring symptoms (left), the front and reverse of cultures on potato dextrose agar (PDA) medium (middle), and microscopic pictures of conidia or mycelia on PDA medium (right) from Ceratobasium cereale (A), Pyrenophora teres (B), P. avenae (C), Alternaria alternata (D), Epicoccum tobaicum (E), and Pyrenophora tritici-repentis (F).

보리의 줄무늬병 또는 그물무늬병(leaf stripe 또는 net blotch disease)의 병징(Fig. 2B 왼쪽)으로부터 분리된 균주는 솜사탕과 같이 fluffy한 흰색의 균사를 관찰할 수 있었으며 배양체의 뒷면은 갈색부터 검은색에 이르는 색소가 관찰되었다(Fig. 2B 중앙). 현미경으로 균사체를 관찰할 결과 균사는 격막이 있었으며, 4-12주 동안 배양한 배양체에서 포자 형성을 관찰할 수 없었다(Fig. 2B 오른쪽). 병징 등의 관찰한 특성을 고려하여 Pyrenophora 속 균으로 동정하였다.

귀리의 잎반점(leaf spot) 병징(Fig. 2C 왼쪽)으로부터 분리된 균주는 회색 빛의 솜털 같은 기중 균사가 생기며 배양체의 뒷면은 검은 갈색의 색소를 관찰할 수 있었다(Fig. 2C 중앙). 균사체는 격막이 있었으며, P. avenae의 전형적인 포자가 PDA 배지에 기주인 귀리를 멸균하여 기질로 올려두었을 때 관찰되었다(Fig. 2C 오른쪽). 포자의 크기는 길이×너비가 115-130×25-30 µm (n=20)였다. 관찰한 특성을 종합하여 잠정적으로 P. avenae로 동정하였다.

맥류(보리, 밀, 귀리)의 점무늬(brown spot) 병징(Fig. 2D 왼쪽)으로부터 분리된 균주의 경우 균사는 회갈색이었으며 균사체의 뒷면은 검은 갈색의 색소를 관찰할 수 있었다(Fig. 2D 중앙). 현미경으로 관찰한 결과 균사는 격막이 있었으며, 포자가 연달아 사슬을 이루며 총알탄 모양의 전형적인 Alternaria 속 균의 특징을 보였다. 특히 포자로부터 작은 소형분생포자(micro-conidium)도 한 개의 대형분생포자(macroconidium)에서 한 개 또는 두 개 생성되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2D 오른쪽). 대형분생포자의 크기는 길이×너비가 20-35×5-15 µm (n=100) 범위였다. 소형분생포자의 크기는 길이×너비가 8-12×4-6 µm (n=20) 범위였다. 병징, 균총의 모양, 포자의 모양, 크기 및 특성을 고려하여 잠정적으로 Alternaria 속 균으로 동정하였다.

맥류(보리, 밀, 귀리)의 갈색 점무늬(brown leaf spot) 병징(Fig. 2E 왼쪽)으로부터 분리된 균주는 균총의 색이 샤프란 같은 노란색을 띠었으며, 배지의 뒷면에서는 암갈색의 색소를 관찰할 수 있었다(Fig. 2E 중앙). PDA에서 배양한 지 2주 만에 황금색에서 적갈색의 구형의 포자를 관찰할 수 있었는데(Fig. 2E 오른쪽), 포자의 크기는 직경 15-23 µm (n=100) 범위였다. 관찰한 특성을 고려하여 Epicoccum 속 균으로 동정하였다.

밀의 황갈색반점(tan spot) 병징(Fig. 2F 왼쪽)으로부터 분리된 균주는 회갈색-황갈색을 띠는 균사가 관찰되었으며, 배양체의 뒷면은 황갈색의 색소를 관찰할 수 있었다(Fig. 2F 중앙). 균사체는 격막이 있었으며, PDA 배지에 기질로서 밀의 잎을 올려두었을 때 길쭉한 균사와 같은 포자가 관찰되었다(Fig. 2F 오른쪽). 포자의 크기는 다양하였으며 길이×너비가 45-150×4-6 µm (n=20) 범주였다. 관찰한 특성을 고려하여 P. tritici-repentis로 동정하였다.

보리에서 분리된 3개의 균주는 병징과 균학적인 특성을 기반으로 Cladosporium sp.로 동정하였다. 밀에서 분리된 5개의 균주는 각각 균총의 특성으로 3개와 2개가 동일한 곰팡이 속으로 추정되어 균학적인 특성을 통해 각각 Fusarium sp.와 Nigrospora sp.로 동정하였다.

맥류에서 수집한 곰팡이 병 균주의 분자생물학적 동정

분리된 총 92개 균주의 형태학적 특성과 더불어 분자생물학적인 특성을 통한 종 동정을 위해 ITS 영역 염기서열 정보를 확보하였다. 확보된 염기서열을 editing한 뒤, NCBI의 BLAST 검정을 통해 99.1-100%의 percent identity 범위 내에서 가장 높은 Query coverage를 보일 경우 동일 종으로 구분하였다(Table 1).

2020년에 분리된 32개 균주의 23개(71.9%) 균주가 잎집눈무늬병의 원인 병원균인 C. cereale로 동정되었다. 뒤이어 5개(15.6%)와 4개(12.5%) 균주가 각각 잎반점병균(또는 종자흑변병균) P. avenae와 갈색점무늬병균 Epicoccum tobaicum으로 동정되었다(Fig. 3A, D).

Fig. 3.

The pie charts of the collected fungal isolates and table of the collected isolates corresponding to the pie graphs. Distribution pie graphs by species of isolates collected in 2020 (A), 2021 (B), and 2020-2021 (C). (D) The percentage distribution of the obtained fungal isolates between 2020 and 2021.

2021년에 분리된 60개 균주들은 총 9개의 다른 곰팡이 종으로 동정되었다. Pyrenophora teres가 20개(33.3%)로 가장 높은 빈도로 분리되었으며, C. cereale가 16개(71.9%)가 그 뒤를 이었다. Alternaria alternata에 의한 점무늬병이 보리, 밀, 귀리의 잎에서 관찰되었으며 분리된 균주도 6개(10.0%) 확보되었다. 그 뒤로는 P. avenae (5개 균주, 15.6%), Cladosporum sp. (3개 균주, 5.0%), Pyrenophora tritici-repentis (3개, 5.0%), Fusarium sp. (3개, 5.0%), E. tobaicum (2개, 3.3%) 그리고 Nigrospora oryzae (2개, 3.3%)로 동정되었다(Fig. 3B, D).

2020년부터 2021년 2년간 수집한 92개 균주들 중 잎집눈무늬병균 C. cereale (39개, 42.4%)가 가장 높은 빈도로 분리되었다(Fig. 3C, D). 그 다음으로는 P. teres (20개, 21.7%), P. avenae (10개, 10.9%), A. alternata (6개, 6.5%), E. tobaicum (6개, 6.5%), P. tritici-repentis (3개, 3.3%), Cladosporium sp. (3개, 3.3%), Fusarium sp. (3개, 3.3%), Nigrospora sp. (2개, 2.2%) 순이었다(Fig. 3C, D).