구상나무 근권 토양 채집은 대한민국 경상남도 산청군 시천면 지리산 국립공원의 세석대피소 근처에서 진행하였다(35°19′4"N 127°41′36"E). 구상나무의 근권 및 토양 미생물 분석 시료는 2023년 4월 20일, 6월 23일, 9월 13일, 11월 11일에 채집하였고, 시료 채집 지역은 구상나무의 자생지(rhizosphere of native trees), 대체서식지(rhizosphere of cultivated trees), 고사지(soil of dead trees), 구상나무 비재배토양(bulk soil) 총 4종류의 지역에서 채집하였다(Table 1, Fig. 1). 구상나무의 자생지, 대체서식지 및 고사지에서의 토양 시료는 구상나무 뿌리와 직접적으로 접촉하는 토양을 채취하였고, 구상나무 비재배토양은 구상나무로부터 1 m 이상 떨어진 위치에서 채취하였다. 구상나무의 자생지, 대체서식지, 고사지에서는 각 서식지당 3개체의 구상나무에서 50 ml의 토양을 conical tube를 이용해 채취하였고, 구상나무 비재배토양은 50 ml의 토양을 conical tube로 3회 채취하였다(n=3). 따라서 1회 시료 채집당 총 12개의 구상나무 근권 및 토양 시료를 채집하였고 최종적으로 48개의 시료를 확보하였다. 확보한 모든 시료들은 −80° C에서 저온 보관하였다.

구상나무의 근권 및 토양 미생물 분석을 위해 채집한 토양 샘플의 DNA는 Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, Irvine, CA, USA)을 사용하여 추출하였다. Fast DNA SPIN Kit for Soil을 이용한 토양 DNA 추출은 토양 0.5 g을 제조사의 지침에 따라 진행하였다. 추출한 DNA의 품질과 추출양은 NanoDrop™ 2000/2000c spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 기기를 사용하여 측정했다. 추출한 DNA는 −30° C에서 저온 보관하였다.

확보된 구상나무 근권 시료의 DNA는 16S rRNA V4 영역을 증폭하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)을 진행하였다. PCR의 진행은 다음과 같다. 먼저 같은 시료를 3회 반복해서 PCR하여 DNA의 농도를 높였고 PCR 기기는 T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 기기를 사용하였다. DNA 1 µl, MISeq 515F 1 µl, MISeq 805R 1 µl, KAPA HiFi Hot Start ReadyMix (Roche, Basel, Switzerland) 12.5 µl, 멸균수 4.5 µl를 혼합해 전체 용량을 20 µl로 맞춘 후 PCR 기기의 설정을 95° C에서 3분(1 cycle), 95° C에서 30초, 58° C에서 30초, 72° C에서 30초(30 cycle), 72° C에서 3분(1 cycle)으로 하여 PCR을 진행하였다. 프라이머는 MISeq 515F(5′-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG GTG YCA GCM GCC GCG-3′)와 MISeq 805R(5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3′) 10 pmol/µl를 사용하였다.

PCR이 완료된 후 PCR 산물 20 µl와 10× loading buffer 2 µl 를 혼합하여 2% agarose gel (ethidium bromide 0.004%)에 투입하여 100 V에서 25분 동안 전기영동을 진행하였다. 정제가 완료된 DNA는 −30° C에서 저온 보관하였다.

근권 세균 DNA의 차세대 염기서열 분석은 마크로젠사(Seoul, Korea)에 의뢰하여 진행하였다. Metagenome amplicon sequencing 기기는 Herculase II Fusion DNA Polymerase (Agilent Tech-nologies, Santa Clara, CA, USA), Nextera XT Index V2 Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하였고 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Part # 15044223 Rev. B 방법에 의거해 분석을 진행하였다. Sequencer type 은 Illumina system을 이용하였다(Latif 등, 2020). Bacteria data의 FASTQ 형식의 raw sequencing data는 R software (version 4.0.3)의 DADA2 (version 1.28.0) 패키지를 사용하여 분석하였다. 두 종류의 시료는 Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 (DADA2)를 사용하여 오류율을 측정하고 평균 품질 점수가 30점 이하인 sequence를 trimmed하였다. 따라서 DNA의 forward reads는 240 bp, reverse reads는 200 bp 길이로 잘라냈다. 다음으로 DADA2 알고리즘을 사용하여 forward reads와 reverse reads를 병합하고 Amplicon Sequence Variants (ASVs)로 클러스터링한 이후 chimeric ASVs를 제거하고, 미토콘드리아와 엽록체 ASVs를 제거하였다. 가공이 완료된 데이터의 분류학적인 분류는 SILVA_SSU_ r138_2019.RData (https://figshare.com/articles/dataset/SILVA_SSU_r138_2019_binder_RData/12622571) 데이터베이스를 참조하여 IDTAXA 알고리즘을 사용하여 수행하였다. 미생물 군집 구축(microbiota community construction)은 vegan (version 2.6.4), phyloseq (version 1.44.0), ggplot2 (version 3.4.2), dplyr (version 1.1.4) 등의 R 패키지를 사용하여 진행하였다(Cho 등, 2022). 그 후 샘플 또는 분류학적 그룹에서 유전자의 상대적 풍부함(relative abundances)을 결정하기 위해 SILVA_SSU_r138_2019.RData 데이터베이스에서 얻은 정보를 PICRUSt2를 이용하여 whole-metagenome shotgun sequencing 결과로 변환하였다. 이후 MISeq 515F, MISeq 805R primer와 barcode sequence를 제거하고 only bacteria% 수치를 확인한 결과 48개로 구성된 모든 시료가 60% 이상이 세균의 DNA인 것을 확인하였다(Table 2). 다음으로 DADA2 platform을 통해 filtering된 track file 결과 중 input file과 비교하여 세균이 60% 이상으로 확인된 경우 추후 분석의 사용 가능 여부를 재판단하기 위해 Good's coverage, Chao's coverage 분석을 시행하였다. 그 결과 모든 시료의 Good's coverage, Chao's coverage 수치가 99% 이상임을 확인하였고, 따라서 전체 데이터가 세균 군집 분석이 가능한 데이터임을 확인하였다(data not shown).

데이터의 가동 이후 데이터의 시각화 및 통계 분석은 R software를 사용하여 진행하였다. 시각화한 데이터 중 희박화 곡선(rarefaction curve), 알파 다양성(alpha diversity), 베타 다양성(beta diversity) 분석은 ggplot2 (version 3.4.2), ggh4x (version 0.2.6) 등의 R 패키지를 사용하여 시각화하였고, 주성분 분석(principal component analysis)은 vegan (version 2.6.4) 등의 R 패키지를 사용하여 시각화하였다. 먼저 희박화 곡선 분석으로 샘플의 수가 증가함에 따라 분류된 종의 다양성이 증가하는 정도를 파악하였다. 희박화 곡선 그래프의 x축은 분석한 DNA의 길이이고, y축은 클러스터링된 ASVs의 개수이다. 알파 다양성 분석의 경우 Observed index, Shannon index, Simpson index 분석을 4월, 6월, 9월, 11월 데이터에서 각각 진행하였다. 다음으로 정규성과 등분산을 모두 만족하는 데이터는 analysis of variance (ANOVA) 통계 분석을 진행하였고 그렇지 않은 데이터는 Kruskal-Wallis test 를 진행하였다. 이후 P-value가 0.05 미만의 수치를 보이는 데이터는 Conover-Iman test를 사용하여 사후검정을 진행하였다. Conover-Iman test는 Benjamini-Hochberg procedure 방법을 사용하여 데이터를 분석하였다. 사후검정 결과 통계적으로 유의미한 차이가 없는 데이터들은 동일한 알파벳으로 분류하였고 통계적으로 유의미한 차이가 있는 데이터들은 서로 다른 알파벳으로 분류하였다. 베타 다양성 분석은 SILVA_SSU_ r138_2019.RData 데이터베이스와 ASVs 간의 유사성이 100%인 분류군을 그룹화하여 상대적 풍부도 상위 10개의 분류군의 비율을 시각화하였다. 모든 분류군의 상대적 풍부도는 백분율로 변환하였고, 상위 10개의 상대적 풍부도를 가진 분류군 이외의 분류군과 ‘not applicable”로 분류되는 분류군들은 others로 분류하였다. 마지막으로 주성분 분석은 Bray-Curtis Dissimilarity 분석법을 사용하여 지역의 차이에 따른 세균 군집의 변화의 유무를 분석하였다. 이후 pairwise Adonis (version 0.4.1) R 패키지를 사용하여 permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA) 통계 분석법을 이용해 지역 변화에 따른 세균 군집 간의 차이가 통계적으로 유의미하게 발생하는지를 분석하였다. 구상나무의 서식지 차이는 노드 색깔의 차이로 구분하였고, 계절의 차이는 노드의 형태로 구분하였다. 또한 각각의 구상나무 서식지에서 3회 반복하여 채취한 시료의 노드의 평균 좌표는 진한색의 노드로 표현하였다.

알파 다양성 분석의 경우 동정이 된 분류군의 개수만 고려하여 분석한 Observed index와 분류군의 개수와 분류군의 풍부도, 균일도를 같이 고려한 Shannon index, Simpson index를 모두 사용하여 시료를 분석하였다(Hunter와 Gaston, 1988; Shannon, 1948). 그 결과 6월의 Simpson index (P-value=0.02862), 9월의 Simpson index (P-value=0.141), 11월의 Simpson index (P-value=0.09867)에서 지역 간 세균 군집의 차이가 통계적으로 유의미하게 나타나지 않았다. 6월의 Simpson index, 9월의 Simpson index, 11월의 Simpson index을 제외한 시료들에서는 모두 통계적으로 유의미한 지역 간 세균 군집 구성의 차이(P-value<0.05)가 발생하였다(Fig. 3). 4월 채집 시료의 경우 전체적으로 비재배토양과 대체서식지의 세균 군집 구성이 자생지와 고사지의 세균 군집 구성보다 더 다양한 종류의 세균이 균일한 풍부도를 가지고 있었다(Fig. 3A). 6월 채집 시료는 통계적으로 지역 간 유의미한 차이가 보이는 Observed index 에서 대체서식지의 세균 분류군의 다양성이 가장 높았고 그 다음으로 비재배토양의 다양성이 높았다(Fig. 3B). 그에 반해서 자생지와 고사지는 하나의 그룹으로 묶이면서 가장 낮은 세균 다양성을 보였다. 6월 채집 시료의 Shannon index의 경우 4월 채집시료의 경향성과 유사하게 비재배토양과 대체서식지의 세균 군집 다양성과 균일도가 자생지와 고사지의 세균 군집 다양성보다 통계적으로 유의미하게 높았다(Fig. 3B). 9월 채집 시료의 분석 결과는 4월과 6월 채집 시료와 유사한 결과가 도출되었는데 지역 간 통계적으로 유의미한 차이가 있는 Observed index, Shannon index에서 비재배토양과 대체서식지의 세균 군집의 구성이 자생지와 고사지의 세균 군집 구성보다 다양하면서 균일한 풍부도를 가지고 있었다(Fig. 3C). 11월 채집 시료의 경우 통계적으로 유의미한 지역 간 차이를 보이는 Observed index, Shannon index에서 비재배토양의 세균 군집이 다른 지역보다 통계적으로 유의미하게 다양하고 균일한 풍부도를 가지고 있었고 자생지의 세균 군집이 모든 지역 중 가장 낮은 세균 다양성과 풍부도를 가지고 있었다(Fig. 3D). 대체서식지와 고사지의 경우 서로 같은 그룹으로 묶이면서 비재배토양보다는 낮고 자생지보다는 높은 세균 다양성을 가지고 있었다(Fig. 3). 따라서 알파 다양성 분석 결과 4종류의 지역 중 구상나무 비재배토양의 세균 군집이 계절이 변화하더라도 가장 다양한 분류군들로 구성된 군집 상태를 유지하는 것으로 밝혀졌다. 반면에 구상나무 자생지의 경우 다른 지역들보다 세균의 분류군 다양성이 낮으면서 세균의 풍부도가 균일하지 않았다. 또한 상대적으로 구상나무 비재배토양과 대체서식지의 세균 군집이 서로 유사한 다양성을 보였고, 자생지와 고사지의 세균 군집이 서로 유사한 다양성을 보였다. 이와 같은 결과에 의거하여 구상나무 자 생지 근권 토양의 세균 군집은 계절이 변화하더라도 일정한 환경이 유지되어 안정적이기 때문에 특정 분류군이 우점하는 정도가 다른 지역보다 높다고 판단하였다. 또한 자생지와 고사지의 경우 자연 상태의 토양 시료이기 때문에 해당 지역에서 오랫동안 유지된 토양이라 서로 유사한 세균 군집 구성을 보이는 것으로 판단된다. 반면에 비재배토양과 대체서식지의 세균 군집 구성의 상대적 유사성은 비재배토양의 경우 식생이 거의 존재하지 않은 구역에서 채집하였고, 대체서식지는 인공적으로 조성된 지역이다. 때문에 두 토양의 환경 변화가 계절에 따라 변화하는 정도가 상대적으로 심해서 두 지역이 유사하게 나타난 것으로 판단된다.

베타 다양성(beta diversity) 분석의 경우 세균의 분류체계 중 문(Phylum), 과(Family) 단계에서 지역과 계절별로 상위 10개의 상대적 풍부도를 가진 분류군의 목록을 분석하였다. 그 결과 문에서는 모든 지역에서 Proteobacteria문, Acidobacteriota문, Actinobacteriota문이 가장 풍부하게 존재하였다. Proteobacteria문은 약 35% 이상의 가장 높은 풍부도로 존재하였고 그 다음으로 Acidobacteriota문이 약 20%, Actinobacteriota문이 약 15% 정도의 풍부도로 존재하였다. 따라서 상위 3개 문이 전체 풍부도의 약 70%가량을 차지하였다. 이러한 경향성은 계절이 변화해도 유사하게 유지되었다(Fig. 4A). 결과적으로 세균의 분류체계 중 문 단계의 분석에서는 지역과 계절 변화에 따라서 세균 군집을 구성하는 분류군에 큰 변화가 일어나지 않았다. 다음으로 과 단계의 분류체계에서의 분석 결과 풍부도 상위 10개의 분류군들 중 Xanthobacteraceae과가 전 지역에서 약 5% 정도의 풍부도로 가장 풍부하였고 두 번째로 풍부한 Nitrosomonadaceae 과는 모든 지역에서 4월에 1% 이하의 낮은 풍부도를 보였다가 6월, 9월, 11월에 약 5% 정도로 풍부도가 증가하는 형태를 보였다. 그 이외의 나머지 분류군들은 모두 풍부도의 차이가 크게 나지 않았고 others로 분류된 분류군들이 전체의 약 70% 정도를 차지하는 것으로 분석되었다(Fig. 4B). 과 단계의 분류체계 분석에서는 문 단계의 분류체계 분석과 마찬가지로 지역, 계절의 변화에 따른 세균 분류군의 풍부도에 별다른 변화가 일어나지 않았다. 또한 과 단계의 분석에선 다양한 종류의 분류군들이 세균 군집을 구성하지만 분류군 각각의 풍부도는 매우 낮은 특징을 보이기 때문에 전체 군집을 구성하는 분류군의 약 70% 정도가 others로 분류되는 결과가 산출되었다(Fig. 4). 따라서 베타 다양성 분석 결과에서는 지역이나 계절의 변화에 따라서 변화하는 세균 군집을 구성하는 분류군들의 유의미한 변화를 찾을 수 없었다.

주성분 분석(principal component analysis)의 경우 구상나무의 근권 및 토양 채집 지역의 계절 변화에 따라서 세균 군집에 어떠한 차이가 발생하는지 파악하기 위하여 분석을 진행하였다. 분석은 세균의 계통 수준에서 동정이 된 군집 내의 차이를 Bray-Curtis Dissimilarity 분석법을 사용하여 수치적 차이로 변환하였다(Fig. 5). 그 결과 구상나무 자생지, 대체서식지, 고사지에서는 노드의 위치 변화가 계절이 변화하더라도 크지 않는 반면에 구상나무 비재배토양에서는 계절이 변화했을 때 노드의 위치가 나머지 지역들에 비해서 크게 변화하였다(Fig. 5). 이후 모든 유형의 시료를 PERMANOVA 분석법을 사용하여 지역 간에 유의미한 차이가 있는지 통계적으로 검증하였다(Anderson, 2017). 전체 데이터의 PERMANOVA 분석의 경우 지역 간의 세균 군집 구성에 매우 유의미한 차이가 발생하였다(P-value=0.001). 이후 전체 데이터에서 어떤 지역 혹은 계절의 변화가 이러한 차이를 발생시켰는지 알아보기 위하여 한 가지 유형의 지역만 분리하여 각각의 지역에서 PERMANOVA 분석을 진행하였다. 그 결과 구상나무 비재배토양에서만 계절 변화에 따른 통계적으로 유의미한 차이가 발생했다(P-value=0.019). 반면 자생지, 대체서식지, 고사지에서는 계절이 변화해도 통계적으로 유의미한 세군 군집의 차이가 발생하지 않았다. 결론적으로 구상나무의 세균 군집의 계절의 변화에 따른 세균 군집 구조 차이는 유일하게 비재배토양에서만 확인되었고 나머지 지역에서는 차이가 확인되지 않았다. 이는 구상나무의 근권에 존재하는 세균 군집이 식물과 밀접한 상호작용을 하여 온도, 습도 등의 환경 변화에 덜 민감하게 반응하는 반면에 식물이 존재하지 않는 토양에서는 환경 변화가 세균 군집의 변화를 야기하기 때문인 것으로 추정된다(Chaparro 등, 2014). 또한 이러한 세균 군집의 변화는 식물이 존재하는 토양에서는 유의미하게 확인되지 않으므로 후속 연구에서의 근권 세균 군집 분석시 계절적인 영향력은 다소 낮게 반영해야 할 것으로 판단된다(Bei 등, 2021). 추가적으로 구상나무와의 상호작용을 하는 근권의 세균 군집을 구성하는 특정 분류군의 존재 유무를 분석한 결과 구상나무 자생지와 대체서식지에서 특이적으로 높은 풍부도를 보이는 분류군은 찾을 수 없었다.

결론적으로 본 연구에서 구상나무와 밀접한 상호작용을 하는 특정한 세균 분류군이 존재하는지는 명확하게 알 수 없었고, 구상나무 비재배토양을 제외한 나머지 지역 간의 세균 군집의 구조의 차이도 크게 나지 않았다. 이와 같은 결과가 도출된 원인은 세균 군집을 구성하는 세균의 종 다양성이 매우 높아 특정 분류군이 우점하는 비율이 높지 않기 때문인 것으로 추측된다(Alawiye와 Babalola, 2019). 또한 보호종인 구상나무의 특성상 식물체의 손상을 최소화하기 위해 근권 시료 채집 시 구상나무와 밀접한 상호작용을 하는 세균이 존재할 가능성이 높은 뿌리 끝부분에 위치한 잔뿌리의 근권을 채집하지 못하였다(Hawes 등, 2002; Ji 등, 2022). 때문에 시료 채집 위치의 문제로 구상나무와 상호작용하는 특정한 분류군을 찾지 못했을 가능성이 있다. 추가적으로 4종류의 지역에서 한 지역당 3회의 시료 채집 반복수를 가지고 연구를 진행하였는데 너무 적은 반복수로 인하여 채취한 시료가 해당 구역의 세균 군집 구조에 대한 대표성을 가지기에 어려웠을 수 있고, 서로 다른 지역의 세균 군집 간의 통계적인 차이를 불분명하게 했을 가능성이 있다. 그러나 구상나무의 자생지와 구상나무 세균 군집이 계절이 변화해도 유사한 군집 구성을 유지하는 것에 비해 비재배토양의 세균 군집의 구성은 계절 변화에 더 민감하게 변화하였기 때문에 근권 세균 군집의 구성이 구상나무와 완전히 무관하다고 판단하기에는 다소 어려울 것이다(Xu 등, 2023). 또한 근권에 존재하는 세균의 종류는 매우 다양하기 때문에 낮은 풍부도를 가지면서 구상나무와 높은 상호작용을 하는 특정 세균이 존재할 가능성이 있다(Dawson 등, 2017; Dohrmann 등, 2013). 다양한 종류의 근권 세균이 식물의 건강에 도움을 줄 수 있으므로 이러한 세균 분류군에 대한 연구는 구상나무의 보존에 기여할 것이다(Xu 등, 2018). 선행 연구에 따르면 Azospirillum, Nitrospirillum 과 같은 구상나무의 생존에 도움을 줄 수 있는 특정한 세균이 실제 존재한다(Mannaa 등, 2023). 반면에 다른 사전 연구에 따르면 구상나무의 자생지와 고사지 간의 미생물 군집 구조의 차이가 세균 군집보다 진균 군집에서 더 유의미하게 나타나는 것으로 알려졌다(Jeong 등, 2023). 때문에 세균 군집이 식물과 상호작용하는 정도가 상대적으로 낮아 시료 채집 지역에 따른 특이적인 세균 군집이 발견되지 않았을 가능성이 있다(Burke 등, 2006). 그러므로 구상나무 근권에 존재하는 다양한 미생물들 중에서 상당히 많은 비중을 차지하는 진균 군집에 대한 추가적인 연구도 진행할 필요성이 있다(Liu 등, 2019; Phillips와 Fahey, 2006). 이러한 결과를 바탕으로 추후 구상나무의 근권 및 토양 세균 군집 분석을 진행하여 구상나무의 존속을 위한 새로운 미생물 자원을 확보하고자 한다면 상기한 문제점들을 개선하여 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.