시험구 배치는 무처리(untreatment), 식물성(oil cake fertilizer), 동물성(amino acid fertilizer), 관행(nitrogen, phosphorus, potassium) 비료를 사용하고, 식물추출물(plant extract)과 미생물제제(microbial agent)를 분할구 배치법(split-plot design)으로 실시하였다. 본 실험에서 사용된 유기농 제제 및 관행농 제제는 시중에 시판되고 있는 제품 중 무작위로 선발하여 사용하였음으로, 본 연구결과에서 제제의 생산자 및 제품의 정확한 품명은 공개하지 않는다. 고추 재배시 시비는 고추 표준시비량(19-11.2-14.9 kg/10 a: N-P₂O₅-K₂O)을 참고하여 질소와 칼륨은 3회 처리하고(관행재배), 식물성 처리구는 유박을 전량 시비하였으며, 동물성 비료 처리구는 동물성 아미노산 비료(8.7 kg/10 a)를 3회 시비하였다. 그리고 무처리는 시비하지 않았다. 미생물제제는 Bacillus velezensis G341 (1.0×10⁷ cfu/ml)과 Lysinibacillus sphaericus TC1 (5.0×10⁵ cfu/ml)을 혼합 사용하였으며, 식물추출물인 오배자 추출물을 2주 간격으로 3회 관주 및 엽면 살포를 하였다(Table 1). 관행재배의 처리는 농가의 관행 시비에 맞게 살포하였으며 본 시비는 3년간 동일한 방법으로 수행하였다. 미생물상 조사를 위한 토양 시료 채취는 고추 작기중 3회에 걸쳐 채취하였다.

근권토양 내 미생물의 DNA를 추출하기 위해서 FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedicals, Irvine, CA, USA)와 FastPrep instrument (MP Biomedicals)을 사용하였으며, Nanodrop 2000c (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 DNA를 정량하였다. 16S rRNA를 증폭하는 universal primer인 341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)와 805R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)를 사용하였다(Herlemann 등, 2011). 추출한 DNA는 Chunlab (Seoul, Korea)에 의뢰하여 16S rRNA중 V3-V4 region을 증폭시킨 다음 next generation sequencing인 Illumina MiSeq을 이용하여 미생물 군집구조를 분석하였다. 미생물상 분석은 2016년도와 2017년도에 고추를 수확한 후 근권토양을 대상으로 총 2회 실시하였다.

고추 재배는 9.5 m×33 m의 포장 구역에 각각 2.5 m×10 m의 유박, 동물성 비료, 무처리의 비배관리 처리구로 구성되었으며, 각 비배관리 처리구는 3 m×1.2 m 규모의 미생물, 식물추출물, 무처리구의 유기농자제 투입구로 구성되었다. 고추의 재식 간격과 이랑의 폭은 약 30 cm로 각 구획당 80주가 식재되었다. 관행농 처리구는 2.5 m×10 m로 조성하여 실험을 수행하였다. 비료 및 약제 처리구간별 탄저병, 바이러스, 청고병을 육안으로 조사하였다. 포장의 크기를 고려하여 한 반복당 고추 3그루를 임의로 선발한 후, 고추 한 그루에 발생한 탄저병의 비율을 구하였으며, 바이러스 병과 청고병 또한 한 반복당 발병개체의 비율을 조사하였다. 고추 밭고랑 사이의 토양을 깊이 10 cm를 걷어내어 각 처리구당 3번의 토양을 채집하였다. 매년 3회 실시하였으며 한 처리구당 3개의 토양 샘플을 균일하게 섞어 1 g이 되도록 하였다. 멸균수 10 ml을 넣은 후, 1/10씩 희석하여 만든 시료를 TSA 배지(tryptic soy agar; pancreatic digest of casein 17.0 g, papaic digest of soybean 3.0 g, dextrose 2.5 g, sodium chloride 5.0 g, agar 20 g per liter)에 도말하였다. 도말된 TSA 배지에서 세균의 균총만을 대상으로 분리하여, 탄저병 길항 미생물 조사를 위해 각 처리구의 토양에서 30개의 균을 임의로 선발하여 탄저병 원인균(Colletotrichum gloeosporioides, KACC 40690)과 PDK 한천배지(potato dextrose pepton; potato starch 1.7 g, dextrose 8.3 g, pepton 10 g, agar 20 g per liter) 상에서 대치배양을 통해 확인하였다.

토양 내 미생물 밀도의 비교를 위해서 One-way ANOVA와 사후분석(Tukey HSD)을 이용하였으며, 탄저병, 바이러스, 청고병에 대하여 조사한 내용은 Three-way ANOVA 와 사후분석(Scheffe method)을 이용하여 분석을 진행하였다. 분류학적 동정은(taxonomic assignment) SILVA database (http://www.arb-silva.de/)를 사용하여 문(Phylum)단계에서 미생물 군집을 그래프로 나타냈다. 그래프의 시각화는 ggplot2 version 3.2.1 (R package)을 사용하여 작성하였다.

토양 시료를 1/10씩 순차적으로 희석한 시료를 TSA 배지에 도말하여 cfu를 측정하여 처리구별로 비교를 하였다. 그 결과 토양 내 미생물 밀도는 10⁷ cfu/g of soil의 밀도를 보였다(Fig. 1). 분산분석결과 연도별 비료처리에 따른 미생물 밀도의 차이는 통계적으로 유의한 결과를 나타내지 않아 토양내 미생물 밀도는 일정한 것으로 판단된다. 탄저병 길항 미생물 빈도조사를 위해 각 처리구의 토양에서 30개의 균을 임의로 선발하여, 탄저병 원인균(C. gloeosporioides, KACC 40690)과 PDK 한천배지상에서 대치배양을 통해 선발하여 처리 구간별로 길항미생물 빈도를 조사하였다. 2015년에는 탄저병 병원균인 C. gloeosporioides에 대한 길항미생물이 많이 발견되지 않았으나, 2016년 5월, 6월에는 전년대비 많 이 발견되었다가 8월에 급격히 감소하였으며 2017년도에서는 2015년과 비슷한 수준으로 발견되었다(Table 2).

비료 및 약제 처리구간 별로 탄저병, 바이러스, 청고병을 육안으로 조사하였다. 탄저병의 경우 국내에는 C. acutatum, C. gloeosporioides, C. coccodes, C. dematium에 의하여 주로 발병한다고 알려져 있으며(Park과 Kim, 1992), 바이러스에 의하여 생기는 병은 국내에는 BBWV2 (Broad bean wilt virus), CMV (Cucumber mosaic virus), INSV (Impatience necrotic spot virus), PMMoV (Pepper mild mottle virus), TSWV (Tomato spotted wilt virus) 등이 바이러스 병을 일으킨다고 알려져 있으며(Choi 등, 2010), 한 반복 당 발병 개체 비율을 구하였다. 청고병의 경우 1차년도와 2차년도에는 발생하지 않았지만 3차년도에 대량으로 발생하였다. 원인균인 Ralstonia solanacearum가 도관부에 증식하여 기주식물이 급격히 고사하는 식물병으로 알려져 있다(Lebeau 등, 2011). 청고병은 한 반복당 발병개체의 비율을 구하였다. 조사한 내용은 조사시기, 약제, 비료처리에 따른 변화를 Three-way ANOVA와 사후분석(Scheffe method)을 이용하여 분석하였다. 1차년도 탄저병 조사에 따르면, 관행과 유기농가 간의 탄저병 발병률이 매우 크게 차이가 났다. 시험 포장에서 비료(P<0.001), 조사시기(P<0.001)에는 발병에 대하여 유의차가 있었으나 약제(P=0.25)에 대해선 유의차가 없었다. 사후분석에서는 시간에 지남에 따라 4차 조사(9월 15일)까지 꾸준히 증가하는 것으로 나왔으며, 비료에서는 관행, 식물성 비료, 동물성 비료 집단군이 무처리보다 발병률이 낮았다(Fig. 2). 2차년도 조사에서는 조사시기(P<0.001), 비료(P=0.005)에는 발병에 대하여 유의차가 있었으나 약제(P=0.271)에 대해선 유의차가 없었다. 사후분석 결과 1차 조사(7월 22일) 2차 조사(8월 10일)가 같은 집단군으로 분류되어 발병률에 차이가 없었으나, 시간이 지날수록 발병률이 높아졌다. 비료에서는 비료무처리가 집단군 A, 동물성비료가 집단군 B, 식물성비료, 관행구가 집단군 AB로 분류되어 식물성비료와 동물성비료에서 탄저병 발병률이 가장 낮게 나타났다. 3차년도에서는, 조사시기(P<0.001)와 약제(P=0.020)에 대해선 발병률 유의차가 있었고 비료(P=0.301)에 대해선 발병률 유의차가 없었다. 사후분석(Scheffe method) 결과 시기에 따라 각각 다른 4개의 집단군으로 나뉘어 점점 발병률이 증가하는 것으로 나타났으며, 약제에 대하여서는 미생물 제재와 무처리에서 100%의 발병률로 제일 높은 그룹으로 나타났고 그 다음 식물추출물(95% 발병률)이 낮았으며 제일 낮은 그룹은 관행(75% 발병률)으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과는 유기농 재배지에서 고추 탄저병의 관리에 적합한 유기농법의 개발이 시급히 요구되고 있음을 나타내고 있다.

바이러스의 경우에서 1차년도에서는 조사시기(P=0.001), 비료(P<0.001), 약제(P=0.002)에 대해서 유의차가 있었다. 사후분석결과 시기별로는 1-3차(7월 31일, 8월 14일, 8월 27일)가 가장 높은 그룹으로 분류되었으며 3-5차(8월 27일, 9월 15일 9월 30 일)가 가장 낮은 것으로 나타나 발병률이 시간에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 비료의 경우에는 동물성비료가 발병률이 가장 높은 것으로 나타났으며 나머지는 같은 집단으로 나타났다. 약제는 무처리와 식물추출물이 가장 높은 집단으로 분류되었으며 식물추출물과 미생물제제가 그 다음을 구성하였고 관행이 발병률이 가장 낮은 것으로 나타났다. 2차년도에서는 조사시기(P<0.001), 비료(P<0.001)에는 발병에 대하여 유의차가 있었으나 약제(P=0.195)에 대해선 유의차가 없었다. 사후분석 결과 시기별로는 2차 조사(8월 10일) 때 발병률이 높고 비료별로는 식물성비료와 무처리가 같은 집단으로 분류되었으며 비료무처리, 동물성 비료, 관행이 집단군 B로 분류되어 식물성비 료구가 발병률이 가장 높은 것으로 나타났다. 3차년도에는 조사시기(P=0.001), 비료(P<0.001), 약제(P<0.001)에 대해 모두 유의차가 있었다. 사후분석 결과 시기별로는 3차(8월 24일)가 가장 높으며, 1차(7월20일)가 그 다음 낮았고 2차(8월 11일)와 4차 (9월 29일)가 가장 낮은 집단군으로 분류되었다. 비료별로는 비료무처리가 가장 발병률이 높은 것으로 분류되었으며 식물성+동물성 비료가 그 다음으로 낮았고 관행구와 식물성비료 처리구가 발병률이 가장 낮은 것으로 나타났다. 약제별로는 미생물제제가 발병률이 가장 높았으며 식물추출과 무처리가 그 다음 낮은 집단으로 분류되었고 관행이 가장 낮은 것으로 나타났다(Fig. 3). 본 결과는 고추 노지 재배에서 바이러스 병의 경감을 위해 식물 추출물의 이용과 식물성 비료의 사용이 효과적일수 있음을 나타내고 있다.

3차년도 청고병의 경우 조사시기(P<0.001), 약제(P<0.001)에는 발병에 대하여 유의차가 있었으나 비료(P=0.384)에 대해선 유의차가 없었다. 사후분석(Scheffe method) 결과 시기별로는 1차(7월 20일)는 발병률이 가장 낮은 그룹C로 분류되었으며 2차(8월11일)는 B그룹으로 분류되었다. 4차(9월 29일)에서 가장 높은 그룹 A로 분류되었고, 3차(8월 24일)는 그룹 AB로 분류되어 시기에 따라 발병률이 높아졌다. 약제에 따른 결과는 관행이 가장 발병률이 높았으며, 무처리와 미생물제제가 그 다음으로 낮은 집단군으로 나타났고, 식물추출물이 가장 낮았다(Fig. 4). 세균성 병원균에 의해 발생하는 고추 청고병은 미생물제제의 사용이 고추 유기농 재배에 효과적인 방법임을 나타내고 있으며, 향후 청고병 억제 미생물제제에 대한 더욱 깊이 있는 연구가 진행되어야 할 것이다.

미생물 군집구조 분석은 2차년도와 3차년도에 걸쳐 총 2회 실시되었으며, 서열정보당 동정된 operational taxonomic unit (OTU)를 rarefaction curve로 나타내었다. 동정된 OTU 숫자는 최소 677개부터 최대 1,332개가 나왔으며 read수가 더 추가된다 하더라도 새로운 OTU가 발견될 가능성이 적으므로 조사된 미생물군집이 충분히 시료의 미생물군집을 대표하였다(Fig. 5). 미생물 군집의 구성을 살펴본 결과 전반적으로 Proteobacteria와 Firmicute가 가장 많았으며 그 다음으로 Actinobacteria, Acidobacteria, Chloroflexi가 많이 존재한 것을 알 수 있었다(Fig. 6).

Bray-Curtis distance를 이용해 principal coordinate analysis 를 평면상에 도식화하여 비료별 미생물상의 군집 변화 쉽게 나타내었다. 그 결과, 미생물제재와 동물성 비료를 사용한 토양에서 Bacillus와 Lysinibacillus가 다른 처리구에 비해 많이 검출된 것을 볼 수 있었다. 그리고 처리구별 미생물상의 전체적인 분포는 동물성 비료와 미생물 제재를 사용한 토양에서 많은 차이가 나타나는 것을 볼 수 있다. 특히, 2017년 미생물제재를 처리한 토양 군집과 토양 처리구의 미생물 상의 변화가 가장 두드러지는 것을 볼 수 있었다(Fig. 7). 미생물제재를 처리한 토양에서 투입된 미생물의 분포가 많았으며, 그 밀도 또한 높게 조사되었다. 이를 통해서 미생물 처리에 따른 미생물 군집의 차이를 볼 수 있었으며, 미생물제제의 사용이 실제 경작지에 정착이 된 것을 알 수 있다.