호박 과실에 발달된 탄저병의 분생포자층을 멸균된 백금이를 이용하여 1 loop 취한 후, streptomycin(100 μg/ml)이 함유된 potato dextrose agar (PDA) 배지에 획선평판법(streaking plate) 방법을 이용하여 단포자를 분리하였다. 25°에서 3일간 배양하여 자란 균사의 선단 부분을 취해 새로운 PDA 배지에 배양하였다. 순수 분리된 대표균주를 농업유전자원센터에 기탁하였다(KACC47696).

탄저병 증상을 보이는 호박 과실로부터 분리된 대표균주를 균학적 및 형태학적 특징을 관찰하기 위해서 PDA 배지에 25°에서 10일간 배양하였다. PDA 배지상에서의 균총은 하얀색에서 회백색을 띠었고, 오렌지색의 분생포자층을 형성하였다. 분생포자는 투명하고 격벽이 없으며, 양쪽 끝이 약간 뾰족한 방추형이거나 원통형으로 크기는 8.3-14.9×2.9-4.3 μm이다. 부착기는 옅은 갈색의 넓은 타원형 내지 곤봉형 이거나 불규칙한 모양이며, 크기는 7.3-11.5×4.8-7.4 μm이다. 이러한 병원균의 균학적 특성은 C. fioriniae와 일치하였다(Shivas와 Tan, 2009). C. fioriniae는 C. acutatum의 종 복합체로 알려져 있다(Sreenviasaprasad와 Talhinhas, 2005). 그러나 Shivas와 Tan (2009)에 의해 다른 종들과 명확하게 분리되는 종으로 규명되었다(Table 1, Fig. 2A-E).

분리된 대표균주를 PDA 배지에 치상하여 25°에서 10일 동안 배양 후, 형성된 포자를 수확하여 멸균수를 이용하여 1.0×106 conidia/ml로 조정하여 현탁액을 제조하였다. 병원성 검정을 위하여 신선한 호박 과실을 70% 에탄올과 1% NaOCl을 이용하여 표면 살균하였고, 멸균수를 이용하여 2회 씻은 후 건조하여 사용하였다. 접종 방법은 멸균된 needle을 이용하여 상처를 유도한 방법과 상처를 내지 않은 방법을 이용하였으며, 병원균 포자 현탁액을 각각의 처리구에 10 μl씩 pipetting하였고, 무처리구에는 멸균수를 이용하여 같은 방법으로 접종하여 고습도 습실상(95% relative humidity, 25°)에서 발병을 유도하였다. 접종 7일차 모든 접종원에서 멸균수를 처리한 무처리구를 제외한 호박 과실에서 처음 발병한 호박 과실탄저병과 유사한 증상을 보였다. 병든 과실을 재분리 결과 동일한 균이 반복적으로 재분리 되었다(Fig. 1C).

호박 과실로부터 분리된 대표균주의 형태적 특성을 바탕으로 명확한 종 동정을 위해 염기서열 분석을 수행하였다. 대표균주를 potato dextrose broth 배지에서 25°에서 5일간 180 rpm으로 배양한 후, 균체를 걸러 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 genomic DNA를 획득하였다. PCR를 수행하기 위해 internal transcribed spacers and intervening 5.8S rDNA (ITS), partial glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), partial chitin synthase-1 gene (CHS-1), partial histone H3 (HIS3), partial actin gene (ACT), partial β-tubulin gene (TUB2) 영역을 증폭하였다. ITS 영역은 ITS 1/ITS 4 (White 등, 1990), GAPDH 영역은 GDF/GDR (Templeton 등, 1992), CHS-1 영역은 CHS-354R/CHS-79F (Carbone과 Kohn, 1999), HIS3 영역은 CYLH3F/CYLH3R (Crous 등, 2004), ACT 영역은 ACT-512F/ACT-783R (Carbone과 Kohn, 1999), TUB2 영역은 T1/Bt2b (O’Donnell과 Cigelnik, 1997; Glass and Donaldson, 1995) 프라이머를 사용하였다. 각각 영역의 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, 염기서열을 분석하기 위해 Macrogen Co. Ltd. (Seoul, Korea)에 의뢰하였고, SeqMan (DNASTAR, Madison, WI, USA)과 CLUSTRAL W을 이용하여 정렬하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST search를 통하여 상동성을 비교 결과, ACT 영역에서 C. fioriniae 균주와 99% 이상 일치하였고(LC516662), 나머지 영역에서는 C. fioriniae 균주와 100% 일치하였다(KY695261, MN895544, MN974140, JQ949284, AB744086). 대표 균주는 NCBI GenBank에 등록하였다(accession nos. KT728897, MT978180, KT728900, MT978181, KT728898, KT728899). 계통수를 작성하기 위해 분석된 염기서열의 ITS, GAPDH, CHS-1, HIS3, ACT, TUB2 각각의 영역을 연결하여, MEGA 7을 이용하여 maximum likelihood 방법으로 작성하였고, 1,000회 bootstrap을 수행하였다. Reference sequence 로는 C. acutatum의 종 복합체인 C. scovillei, C. nymphaeae, C. simmondsii, C. lupine, C. melonis, C. fioriniae, C. acutatum, C. acerbum, C. salicis, C. godetiae, C. pyricola 균주와 outgroup으로는 C. truncatum, C. gloeosporioides을 사용하였다. 계통수 분석 결과, 대표균주 KACC47696은 C. acutatum의 종 복합체 clade에 속하였으며, C. fioriniae (CBS127600)와 묶여 다른 종들 과 명확하게 구분되었다(Fig. 3.)

C. fioriniae 종은 C. acutatum의 종 복합체로 유전적으로 다른 종들과 명확하게 구별되는 종으로 Clade 3에 속하며 (Damm 등, 2012), Shivas와 Tan (2009)에 의해서 규명되었다. 국내에서 C. fioriniae에 의한 탄저병의 보고는 구기자나무, 복숭아나무, 자두나무, 가지 등에서 보고되었으며(Hassan 등, 2019; Lee 등, 2018; Oo 등, 2016; Xu 등, 2018), 박과 작물에서는 보고가 되어 있지 않다. 또한, 국내에서 호박에 발생하는 탄저병은 C. orbiculare가 보고되어 있으나, C. fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병은 아직까지 보고된 바 없다. 따라서 본 연구는 국내에서 처음으로 C. fioriniae에 의한 호박 과실 탄저병의 발생을 보고하고자 한다.