Control of Red Pepper Anthracnose Using <italic>Bacillus subtilis</italic> YGB36, a Plant Growth Promoting Rhizobacterium

용윤 이; 연미 이; 영수 김; 현섭 김; 용호 전

doi:10.5423/RPD.2020.26.1.8

Res. Plant Dis > Volume 26(1); 2020 > Article

식물생장촉진근권세균Bacillus subtilis YGB36을 이용한 고추 탄저병의 생물학적 방제

Research Article

Research in Plant Disease 2020;26(1):8-18.

Published online: March 31, 2020

DOI: https://doi.org/10.5423/RPD.2020.26.1.8

식물생장촉진근권세균Bacillus subtilis YGB36을 이용한 고추 탄저병의 생물학적 방제

이용윤^1,^†, 이연미^2,^†, 김영수¹, 김현섭¹, 전용호^1,^*

¹ 안동대학교 식물의학과

² 안동대학교 농업과학기술연구소

Control of Red Pepper Anthracnose Using Bacillus subtilis YGB36, a Plant Growth Promoting Rhizobacterium

Yong Yoon Lee^1,^†, Younmi Lee^2,^†, Young Soo Kim¹, Hyun Sup Kim¹, Yongho Jeon^1,^*

¹ Department of Plant Medicals, Andong National University, Andong 36729, Korea

² Agricultural Science & Technology Research Institute, Andong National University, Andong 3679, Korea

^* Corresponding author
Tel: +82-54-820-5507 Fax: +82-54-820-6320 E-mail: yongbac@andong.ac.kr

†These authors contributed equally to this work.

Received February 6, 2020 Revised March 3, 2020 Accepted March 9, 2020

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요 약

고추는 한국의 주요 경제 작물 중 하나이지만 재배과정에서 Colletotrichum acutatum에 기인한 탄저병이 많이 발생한다. 이의 방제를 위해 길항균인 Bacillus subtilis YGB36을 선발 하여 16S rRNA 염기서열 및 생리•생화학적 분석을 통해 Bacillus subtilis로 동정하고 이를 생물학적 방제제로 개발하고자 실험을 진행하였다. In vitro screening에서 YGB36은 Cylindrocarpon destructans에 강한 항균활성을 나타내었고, cellulase, prote- ase, amylase, siderophore 생산 및 phosphate solubility를 보유하고 있었다. 이 균주의 배양액(106 cfu/ml) 및 배양여액은 in vitro 실험에서 C. acutatum의 포자발아를 강하게 억제하였고, 고추 과실을 이용한 실내실험에서도 이 배양액이 탄저병 병반의 진전을 억제하였으며, 방제가는 65.7%로 나타났다. 아울러 YGB36배양액은 고추 종자의 발아 및 초기 뿌리 생장을 촉진하였고, 온실에서의 식물 생장을 촉진하였다. 기존 화학농약과의 혼용 가능성 조사 결과, YGB36은 실험에 사용한 모든 살충제에서 생존에 영향을 전혀 받지 않았으며, 살균제 21종 중 11종에서 잘 생존하였다. 따라서 YGB36균주는 고추 탄저병에 대한 생물농약으로서의 잠재적 가치가 상당한 것으로 판단된다.

ABSTRACT

Red pepper, one of the major economic crops in Korea, is being affected by anthracnose disease caused by Colletotrichum acutatum. To control this disease, an antagonistic bacterial strain, Bacillus subtilis YGB36 identi- fied by 16S rDNA sequencing, physiological and biochemical analyses is used as a biological control agent. In vitro screening revealed that the strain YGB36 possess strong antifungal activity against the pathogen Cylindrocarpon destructans. The strain exhibited cellulase, protease, amylase, siderophore production and phosphate solubility. In vitro conidial germination of C. acutatum was most drastically inhibited by YGB36 cell suspensions (106 cfu/ml) or culture filtrate. Development of anthracnose symptoms was reduced on de- tached immature green pepper fruits by treatment with cell suspensions, and its control value was recorded as 65.7%. The YGB36 bacterial suspension treatment enhanced the germination rate of red pepper seeds and promoted root development and growth under greenhouse conditions. The in vitroscreening of fungicide and insecticide sensitivity test against YGB36 revealed that the bacterial growth was not affected by any of the insecticides, and 11 fungicides out of 21 used. Collectively, our results clearly suggest that the strain YGB36 is considered as one of the potential biocontrol agents against anthracnose disease in red pepper.

Keywords: Anthracnose, Bacillus subtilis , Biological control agent, Red pepper, YGB36

서 론

고추(Capsicum spp.)는 열대성 식물로 우리나라에서 주요 경 제작물로 자리 잡고 있고, 조미 채소류 중 가장 넓은 재배면적 을 차지하고 있다. 그러나 최근 기상이변과 재배 농민의 고령화 등에 따라 재배의 어려움을 겪고 있을 뿐만 아니라, 우리나라에 서는 연작, 소규모 재배, 노동 집약, 긴 재배 작기로 인해 여러 병 해 피해가 큰 작물이기도 하다(Park 등, 2012). 우리나라에 보고 된 고추에 발생하는 병해는 35종이며, 그 중 역병과 탄저병, 모 자이크병 등 약 10종의 병이 매년 고추에 큰 피해를 주는 것으 로 보고되었고, 고추탄저병과 역병이 가장 심각한 피해를 일으 키고 있다(Seo 등, 2011; The Korean Society of Plant Pathology, 2009). 고추탄저병균 중 수량과 품질에 직접적인 영향을 미치는 균은 C. acutatum과 C. gloeosporioides로 알려져 있으 며 최근에는 C. acutatum이 주로 발생한다고 보고되었다(Kim 등, 2008). 주로 미숙한 과실로부터 수학 후까지 발생하며 수침 상으로 음푹 들어간 원형 반점으로 나타나고 병반 윗부분에 담 황색 내지 핑크색이나 오렌지색의 포자 덩어리 증상을 보이며 식물체 전 생육기에 걸쳐 고추 과실에서 강한 병원성이 보고된 바 있다(Han 등, 2009).

탄저병 방제를 위해 사용하는 화학농약은 dithianon, carbendazium, chlorothalonill, azoxystrobin, mancozeb 등이 있 지만, 생태계 파괴와 같은 문제점과 C. acutatum의 약제 내성 등으로 인하여 방제에 어려움이 있다(Kwak 등, 2012). 이에 저 독성이면서 환경에 해가 없는 생물적 방제에 있어서 특히 병원 균에 항균력을 보이는 미생물을 이용한 생물학적 방제가 관심 을 끌고 있으며, 토양에서 Bacillus sp., Psedomonas sp., Strepto- myces sp. 등과 같은 미생물을 분리하여 항생물질과 미생물제 의 개발을 위한 연구들이 지속적으로 이루어지고 있다(Kim과 Yun, 2011; Lee, 2010; Paik 등, 1996; Park 등, 2006). 그 중에서도 식물생육촉진 근권세균으로 내생포자(endospores)를 형성하 여 장기간 보존이 가능한 Bacillus종에 대한 개발이 증가하고 있 다(Borriss, 2011; Qiao 등, 2014).

본 연구에서는 고추탄저병을 일으키는 C. acutatum에 대한 생물학적 방제효과가 우수한 Bacillus종을 선발하고 탄저병의 발병 억제 효과 및 식물생장촉진능을 검정하였으며, 실제 농가 에서 기존 화학농약과의 혼용이 가능한 지 여부에 대하여 검토 하고 이를 보고하고자 한다.

재료 및 방법

균주선발.

인삼재배지 토양으로부터 유용미생물을 분리하였다. 인삼 근권의 토양을 채취하여 멸균수에 현탁하여 희석 후 brain heart infusion (BHI) 배지에 도말하고 단일 콜로니의 미생물들을 분리하였다(Park 등, 2013). 길항력이 우수한 미생물 선발을 위해, 인삼뿌리썩음병원균 Cylindrocarpon destructans 포자 현택액을 105 conidia/ml의 농도로 제조하여 potato dextrose agar (PDA) 배지에 도말한 후 상기에서 분리한 단일 콜로니의 미생물들을 각각 살균된 이쑤시개로 묻혀 접종하고 21°C에서 5일간 배양하여 inhibition zone이 형성된 콜로니를 선발하였다.

고추 탄저병균은 한국농업미생물자원센터로부터(Korean Agricultural Culture Collection, KACC) 분양받아 사용하였으며(Collectotrichum acutatum KACC40847, Collectotrichum acutatum KACC42509, Collectotrichum acutatum KACC42403 및 Collectotrichum gloeosporioides KACC42690), 이들 균주의 배양배지에 6-mm cork borer로 고추탄저병 블럭을 잘라 새로운 PDA 배지 중앙에 치상하거나, 포자현탁액 (105 conidia/ml) 100 µl을 제조하여 PDA 배지에 각각 도말한 후, 6-mm paper disc를 치상하고 그 위에 선발된 균주 배양액 10 µl을 접종하여 inhibition zone 형성 여부를 관찰하였다.

16S rDNA 염기서열 분석.

YGB36의 16S ribosomal RNA 유전자 서열의 PCR 증폭을 위해, 27F (5′-AGAGTTTGATCMTG- GCTCAG-3′)와 1492R (5′-GGYTACCTTGTTACG ACTT-3′) 프라이머를 사용하였으며, 증폭된 PCR 산물의 sequencing을 수행 한 후 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 의 BLAST를 이용하여 분석하였다. Phylogenetic 분석에는 MEGA-X가 사용되었다(Kumar 등, 2016; Weisburg 등, 1991).

Biolog, Vitek system을 이용한 동정.

선발된 균주의 탄소원 이용도를 이용한 동정을 위해 Biolog GEN III microplate system (Biolog, Hayward, CA, USA)을 사용하였다. 지침에 따라, 균주 콜로니를 fluid A (Biolog)에 현탁 후 각 100 µl를 GEN III microplate의 모든 well에 접종하여, 28°C에서 42시간 배양하였으며, Biolog MicroStation automated reader를 사용하여 측정 후 MicroLog 3 software (Biolog)를 이용하여 분석하였다. 한편, 해당 균주의 동정을 위해 Vitek system이 사용되었다. Vitek 2 Compact system (bioMérieux, France)에서 BCL카드를 사용하여 제조사의 지침에 따라 진행되었으며, 28°C에서 14시간 배양 후 VITEK 2 Compact software version 07.01으로 분석하였다.

배양특성.

배양 특성을 조사하기 위하여, YGB36을 BHI 액체 배지에 접종한 후 28°C에서 7일간 배양하면서, UV 600 nm에서의 OD값을 매일 측정하였으며, 최초 24시간까지는 6시간 간격으로 측정하였다. 동시에 생균수 측정을 위해, OD값 측정때 마다 배양액의 일부를 취하여 BHI 고체배지에 10-fold dilution plating하여 배양한 후 발생한 콜로니 수를 측정하였다.

효소활성 검정.

Cellulase 생산 여부를 알아보기 위해 CMC agar 배지(carboxyl methyl cellulose 5 g, MgSO₄ 2 g, CaCl₂ 0.5 g, KCl 1 g, FeSO₄ 0.001 g, agar 20 g)를 이용하였다(Sazci 등, 1986). 멸균된 6-mm filter paper를 배지 위 3곳에 올린 후 2곳 에만 YGB36 배양액을 10 µl씩 접종한 후 28°C에서 5일간 배양하였다. 0.1% Congo red 용액으로 배지를 염색한 후 inhibition zone 형성을 관찰하였다. 본 실험은 3반복으로 진행하였다.

Protease 활성은 gelatin을 첨가하여 만든 평판배지(gelatin 5 g, beef extract 3 g, proteose peptone 5 g, agar 15 g)에 YGB36 배양액을 접종하고 5일간 배양한 후, 1% tannic acid 용액으로 염색하여 inhibition zone 형성을 관찰하였다. 본 실험은 3반복으로 진행하였다.

Amylase 활성은 가용성 전분(soluble starch)을 첨가하여 만든 평판배지(beef extract 3 g, proteose peptone 5 g, soluble starch 2 g, agar 15 g)에 YGB36 배양액을 접종하고 5일간 배양 한 후, Gram’s iodine 용액(3.3 g iodine crystal, 2.8 g potassium iodine, 1,000 ml distilled water)으로 염색하여 inhibition zone 형성을 관찰하였다. 본 실험은 3반복으로 진행하였다.

Siderophore 생산 여부는 변형된 Chrome azurol S (CAS) agar assay를 이용하여 측정하였다(Han 등, 2015). CAS (Sigma, St. Louis, MO, USA) 염료 용액은 증류수 50 ml에 CAS 60.5 mg 을 녹이고, 72.9 mg의 hexadecyltrimethylammonium bro- mide를 증류수 40 ml에 녹이고, Luria-Bertani agar 35 g을 증류수 900 ml에 녹인 후 세 가지 용액을 혼합하고 고압 멸균하였다. HCl 용액(10 mM) 10 ml에 1 mM FeCl₃•6H₂O를 녹여 따로 고압멸균하였다. 고압 멸균된 두 용액을 50°C로 식힌 후 섞어주고 Petri dish에 분주하여 CAS 평판배지를 만들었다. 이후 위와 같은 방법으로 세균을 접종하고 28°C에서 5일간 배양한 후, orange halo zone 형성을 관찰하였다. 본 실험은 3반복으로 진행하였다.

인산 분해능(phosphate solubilization)은 tricalcium phosphate가 포함된 배지(glucose 10 g, tricalcium phosphate 5 g, MgCl₂•6H₂O 5 g, MgSO₄•7H₂O 0.25 g, KCl 0.2 g, (NH₄)₂SO₄ 0.1 g, agar 20 g)를 이용하여, 상기와 같은 방법으로 세균 배양액을 접종하고 15일간 배양한 후 halo zone 형성을 관찰하였다. 본 실험은 3반복으로 진행하였다.

In vitro 포자 발아 억제 효과.

YGB36 배양액 및 배양여액을 이용하여 C. acutatum KACC42403의 포자발아 억제 효과를 조사하였다. C. acutatum은 PDA 배지에서 5일간 배양하여 포자 현탁액을 105 conidia/ml 농도로 준비하였고, YGB36은 BHI 액체배지에서 3일간 배양한 배양액 및 이를 MF-Millipore membrane filter (pore size, 0.22 µm)로 여과하여 배양여액으로 준비하였다. 슬라이드 글라스 위에 포자현탁액 10 µl을 분주하고 이에 배양액 또는 배양여액 10 µl를 각각 분주하였다. 습도를 유지하며 25°C에서 배양하면서 8시간 간격으로 48시간 동안 발아(germination) 유무와 부착기(appressorium) 형성을 조사하였다. 포자의 발아는 발아관(germ tube)의 길이가 포자 크기의 1/2 이상 되었을 때로 정의하였으며, 대조구로는 멸균수를 사용하여 위와 같은 방법으로 조사하였다. 포자 발아율은 (1-발 아율/대조구발아율)×100으로 계산하였으며, 모든 실험은 3반복으로 실시하였다.

고추탄저병 발생억제.

시중에서 판매되는 풋고추를 70% ethanol과 2% NaOCl 을 이용한 표면 살균 후 사용하였다. 멸균된 핀을 이용하여 고추 과실 표면 6곳에 상처를 낸 뒤 C. acutatum KACC42403 포자현탁액(105 conidia/ml) 10 µl를 접종한 후 실온에서 건조하였다. YGB36은 BHI 액체배지에 3일간 배양 한 후 20배로 희석하여 분무하였고 대조구는 BHI 액체배지를 이용하여 분무하였다 고추 과실은 습실처리하여 10일간 25°C 로 배양하면서 병 발생을 비교하였다. 모든 시험은 3반복으로 진행하였다. 발병도(%)는 병반 크기에 따라 발병지수를 0, 0% 병징없음; 1, <2 mm; 2, 2-4 mm; 3, 5-7 mm; 4, 8-10 mm; 5, 10mm 초과로 나누어 평가하였고, 발병도는 {∑(발생지수×발병수)/5(최고발병지수)×6(조사수)}×100로 산출하였다. 방제가는 (대조구발병도-처리구발병도/대조구발병)×100으로 산출 하였다.

고추 종자발아 및 생육촉진효과.

YGB36의 고추 생육 촉진 효과 실험은 안동대학교 부속농장 실험실습포 유리온실에서 진행하였다. 36구 포트(27.5 cm×27.5 cm×3.5 cm)에 상토를 채운 뒤 고추종자(Dogyacheongcheong, Syngenta Korea, Seoul, Korea)를 파종하였고, YGB36은 BHI배지에서 3일간 배양 후 멸균수를 이용하여 10배 희석하여 7일 간격으로 관주하였다. 대조구로는 BHI 액체배지를 사용하였다. 발아율 관찰은 파종 후 9일부터 14일까지, 뿌리 생육 측정은 15일 차에, 지상부 길이 측정은 58일 차에 진행하였다. 모든 처리구는 36구 포트의 3반복으로 실시하였다.

화학농약에 대한 저항성 검정.

실험을 위해 현재 청송지역 고추재배 농가에서 최근 3년간 사용된 살균제 21종과 살충제 14종을 이용하였다(Table 1). 3일간 액체 배양한 YGB36의 배 양액 100 µl를 BHI 배지에 도말한 후 적절한 간격으로 4개의 6 mm paper disc를 올리고, 화학농약은 제조사의 지침에서 제시하는 농도(×1)를 중심으로 반량(×0.5) 및 배량(×2)으로 제조하여 각 10 µl씩 분주하였다. 3일간 배양 후 inhibition zone을 관찰하였다. 모든 실험은 3반복으로 진행하였다.

통계분석.

각 처리별 평균 간 차이에 대한 통계는 분산분석 으로 진행하였고, 각 처리 간의 차이는 최소유의차 검정(least significant difference [LSD] test)으로 다중 비교하였으며, R통계 소프트웨어(R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria)를 사용였하다.

결과 및 고찰

균주.

인삼포장의 토양으로부터 인삼썩음병균인 C. destructans에 대하여 강한 항균력을 보이는 균주를 선발하였 고(Fig 1A), 이를 YGB36으로 명명하였다. YGB36 균주는 이외 에도 탄저병균인 Colletotrichum acutatum 3종(KACC40847, KACC42403, KACC42509) 및 Colletotrichum gloeosporioides 1 종(KACC42690)에 대하여 항균활성을 나타내었다(Fig. 1B-F).

동정.

YGB36균주의 게놈DNA를 추출하여 16S ribosomal RNA 유전자를 PCR로 증폭하여 약 1.2 kb의 DNA서열을 얻었으며, 이의 염기서열분석을 통해 계통분류를 진행하였다(Fig. 2). 분석된 phylogenetic tree에서 해당 균주는 Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens 및 Bacillus velezensis와 동일한 그룹에 포함되었고, 이들과는 모두 96.83%의 상동성을 나타내었다. Biolog 분석에서, YGB36 균주는 Bacillus subtilis로 동정되었 으며 이 때 probability는 86.1%였고, Vitek 2 system 분석에서는, B. subtilis/B. amyloliquefaciens/B. atrophaeus로 동정되었으며, probability는 93%였다. 구체적으로, YGB36 균주는 GEN III microplate상에 있는 substrates 중에서 3-methyl glucose, D-serine, glucuronamide, α-keto-glutaric acid, 및 D-malic acid 등에 대해서는 반응이 나타나지 않은 반면에 myo-inositol과 formic acid 등에 대해서는 반응성이 나타났다(Table 2). 이러 한 반응성은 Bacillus amyloliquefaciens와는 구별되는 Bacillus subtilis의 특징이다(VITEK 2 Compact software version 07.01). 한편, Vitek 2 system 동정에서 함께 분류된 Bacillus velezensis는 Bacillus amyloliquefaciens와 상호 매우 유사해서, 많은 Bacillus velezensis가 이전에는 Bacillus amyloliquefaciens로 분류되었다가 최근에야 Bacillus velezensis로 재분류되어 보고되고 있다(Dunlap 등, 2016; Wang 등, 2008). 종합하면, 16S rRNA 염기서열분석, Biolog 및 Vitek분석에서 공통적으로 B. subtilis가 동정되었고, 특 히 Biolog 분석에서 B. subtilis 특이적인 특징을 확인하였으므로 YGB36 균주는 Bacillus subtilis로 최종 동정되었다.

생장곡선 및 효소활성.

액체배지에서 YGB36을 7일간 배양 하면서 샘플링한 후 동일 샘플에 대하여 OD값 측정 및 생균수 계산을 통해 세균수의 증식여부를 확인하고 그래프를 얻었다. 두 방법 모두에서 비슷한 결과을 얻었으며, YGB36을 접종한지 24시간 만에 stationary phase에 진입한 것을 확인하였고(Fig. 3A). YGB36을 접종한지 적어도 6시간까지는 lag phase가 지속된 후에 exponential stage에 진입하였다(Fig. 3B).

YGB36의 항균활성과 관련된 다양한 효소활성을 검정하였다(Fig. 3C). Cellulase 생산 여부 실험을 위해 carboxymethyl cellulose를 이용하였고, protease에 대해서는 gellatin을 이용 하였으며, amylase 생산은 soluble starch를 이용하여 측정하였다. 결과적으로 YGB36은 cellulase, protease 및 amylase 활성이 매우 강한 것으로 나타났다. Bacillus 종에서 이러한 효소 활성은 이미 보고되어 있으며, 본 균주에서도 강한 활성이 확인되었다(Bhaskar 등, 2007; Nakamura 등, 1987; Thippeswamy 등, 2014).

다음으로, 식물생장촉진세균으로서의 YGB36균주의 특성을 알아보기 위하여 siderophore 생산 및 난용성인산에 대한 분해력을 실험하였다. YGB36은 CAS agar 배지에서 halo zone을 형성함으로써 비교적 높은 siderophore를 생산하고 있었으며, tricalcium phosphate가 포함된 배지에서 다소간의 halo를 보여 불용성 인산에 대한 분해능력이 있음을 확인할 수 있었다. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR)은 식물 근권에 존재하면서 철(Fe3+) 성분 결합물질인 siderophore를 생산하 여 철 흡수율을 높임으로써 토양에 있던 유해 미생물과 경쟁적 길항작용을 통해 영향을 줄 수 있다(Bagg와 Neilands, 1987; Kloepper 등, 1980). Siderophore는 식물의 유도전신저항성 (induced systemic resistance)에도 관여하여 식물의 병저항성을 높이는 것으로 알려져 있다(Annapurna 등, 2013; Beneduzi등, 2012). 또한 난용성 인산염을 분해하여 식물이 직접 사용 할 수 있는 형태의 영양원으로 공급해줌으로써 식물의 생장촉진 효과를 볼 수도 있다(Rodrıguez와 Fraga, 1999). 이와 같이 YGB36은 항균활성과 더불어 식물생장에도 도움을 줄 수 있는 유용한 PGPR로 여겨진다.

In vitro 포자발아억제효과 검정.

고추 탄저병균에 대한 YGB36의 항균활성을 알아보기 위하여 포자발아억제효과를 검정하였다(Fig. 4). 멸균수에서 배양한 대조구의 C. acutatum KACC42403 포자는 발아를 시작하여 24시간에 80.5%, 48시간에 95%가 발아하였다. 반면 YGB36 배양액에서는 48시간까지 전혀 발아하지 못하였다. YGB36의 생균이 제거된 배양여액에 서도 포자발아 억제효과는 매우 높게 나타났는데, 24시간까지 전혀 발아하지 못하였고 32시간에 12.4%, 48시간에도 25.2%가 발아하는데 그쳤다. 현미경으로 관찰해 보면, 대조구에서는 최초 관찰시부터 발아관이 나타났고, 32시간에 부착기가 관찰되었으며, 48시간에는 다수의 부착기가 관찰되었다. 반면, 배양여액 처리구에서는 32시간부터 발아가 조금씩 시작하였으나, 관찰을 종료한 48시간까지 어떤 부착기도 관찰되지 않았다. 배양액 처리구에서는 관찰을 종료한 48시간까지 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. B. subtilis가 C. acutatum의 포자발아를 억제한다는 사실이 이미 여러 논문에서 보고되었으며, YGB36 에서도 C. acutatum에 대하여 강한 활성이 나타났다(Lamsal 등, 2012; Živkovic 등, 2010). 또한 B. subtilis CMB32의 배양여액 에는 iturin A, fengycin, surfactin A 등의 lipopetide들이 포함 되어 있고, 이들에 의한 탄저병균에의 항균활성이 보고되었다(Kim 등, 2010; Ongena와 Jacques, 2008).

고추과실에서의 탄저병 발병억제.

고추 과실에 상처를 내어 탄저병균을 접종한 후 YGB36 배양액을 희석하여 분무함으로써, 병 발생 억제 정도를 조사하였다. 발병이 진행된 부위에 서는 전형적인 탄저병균의 병징을 확인할 수 있었으며 발생 병반의 개수와 크기를 이용하여 분석한 결과, 대조구의 발병도는 97.2%임에 반해 YGB36 처리구에서는 발병도가 33.3%로 나타났다(Fig. 5). 방제가는 65.7%로 환산되었다. 이는 YGB 배양액 이 탄저병균의 포자발아 및 균사생장을 억제했던 상기 in vitro 포자발아억제검정 결과와 일치하였다.

고추 종자발아 및 생육촉진효과.

YGB36의 PGPR효과 검정을 위하여, 발아율을 관찰하였다. 발아율은 관찰을 시작한 9일 차부터 차이가 발생하기 시작하여 10일차에 가장 뚜렷한 차이를 보였다(Fig. 6A). 관찰을 종료한 14일차에 대조구에서 97.2%, YGB36 처리구에서는 100%의 발아율을 보였다. 대조구 발아율은 9일차부터 11일차까지 1.9%, 13.0%, 47.2%인 반면, 처리구의 발아율은 23.1%, 49.1%, 96.3%로 나타났다. YGB36를 고추 종자에 처리하였을 때, 대조구에 비하여 보다 빨리 발아하기 시작였고, 2주 후에는 YGB36처리구와 대조구 모두에서 대부분 발아하였다. 결론적으로, 대조구와 YGB36 처리구에서의 최종 발아율은 다소 비슷하나, YGB36 처리구에서의 발아 속도는 현저히 발라진 것을 알 수 있었다. 대부분의 PGPR이 여러가지 기작으로 발아 촉진과 같은 식물 생육에 유용한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는데, 일례로 B. subtilis는 indole-3-acetic acid (IAA)와 같은 식물호르몬을 생산하여 식물과의 상호작용을 한다(Swain 등, 2007). 세균의 IAA는 식물세포의 분열과 확장(expansion)을 촉진하여 뿌리가 출현할 수 있게 함으로써 종자 휴면을 타파하는데 도움을 줄 수 있다는 사실이 잘 알려져 있다(Spaepen 등, 2007). YGB36을 처리하여 나타난 고추종자의 발아촉진도 이와 같은 기작이 관련이 있을 것으로 판단된다.

종자 발아 이후의 초기 생육효과 검정을 위해 파종 후 15일 차에 뿌리 길이를 측정하였다. 대조구는 평균 39.1 mm인 반면 처리구에서는 평균 53.6 mm로, LSD test 결과, P=0.019로 대조 구와 처리구 사이에는 유의성이 있는 것으로 나타났다(Fig. 6B). 따라서, YGB36은 고추 종자 발아 이후의 초기 생육을 촉진하는 것으로 판단되었다.

파종 후 58일이 지나 지상부 길이를 측정하였다. 대조구와 처리구간의 지상부 생육은 육안으로도 구별될 만큼 차이가 컸으며 측정결과, 대조구의 지상부 길이는 평균 25.0 cm인 반면, 처리구의 평균 길이는 28.8 cm였다. LSD test 결과, P<0.001로 대조구와 처리구 사이에는 유의성이 매우 높은 것으로 나타났다 (Fig. 6C). 따라서, YGB36의 고추 생육촉진 효과가 매우 높은 것으로 판단되었다.

화학농약에 대한 저항성 검정.

생물학적 방제제를 화학농 약과 혼용 혹은 교호 살포하였을 때 서로 상충작용을 하는지 알아보기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 상용화되어 있는 살균제 21종 및 살충제 14종을 제조사의 지침을 기준으로 반량, 정량 및 배량으로 제조하여 이에 대한 YGB36의 생육에 의 영향을 확인하였다(Table 1). 총 21종의 살균제 중에서 pyraclostrobin 및 tebuconazole 등의 원제를 포함한 살균제 11종은 YGB36의 생육에 전혀 지장을 주지 않았으며, streptomycin 과 validamycin-A의 합제의 경우 정량 이상에서만 생육 저해가 나타났다. 한편, 실험에 사용한 살충제 14종은 YGB36의 생육 에 전혀 영향을 주지 않았다. 따라서, YGB36과 살균제의 혼용 여부는 살균제 종류에 따라 다르므로, 혼용 시 주의하는 것이 바람직하며, 살충제와의 혼용에서는 이를 고려하지 않아도 될 것으로 판단된다. 다만, 본 연구에서 사용한 살균제 및 살충제가 현재 상용화된 모든 화학농약을 다루지는 못했으므로 생물학적 제제 개발 시 다양한 화학농약 및 다른 미생물제와의 혼용 여부에 대한 연구가 필요할 것으로 판단된다.

자연계에는 아직 탐색되지 않은 유용자원이 많이 존재하고 있으며, 친환경 생물농약으로의 개발가능성이 매우 높은 미생물을 탐색하여 유용자원으로서 활용하는 시도는 오래전부터 이루어져 오고 있다. 본 연구에서 탐색된 YGB36은 강한 항균활 성과 더불어 인삼뿌리썩음병균(C. destructans)과 탄저병균(C. acutatum, C. gloeosporioides)과 같이 넓은 항균스펙트럼을 보유하고 있다. 게다가 siderophore 생산 및 난용성 인산염 분해능 또한 보유하고 있어 이러한 특징들이 식물생장에 직접적인 도움을 줄 수 있을 것으로 기대된다. 실제로 YGB36이 고추에서 가장 문제가 되고 있는 탄저병균을 억제하고, 고추 종자 발아 및 생육촉진까지 긍정적인 효과를 보유하고 있음이 본 연구에서 확인되었다. 아울러 실제 농가에서 주로 사용하고 있는 다양한 화학약제와의 혼용 가능성도 제시하였다. 한편 YGB36은 B. subtilis종으로서, 해당 종은 안전성이 입증되어 이미 오랜 기간 사용되어 온 균주이므로 생물농약으로서의 개발에 한층 용이하다. 이로써 YGB36은 고추탄저병 억제 및 식물생육촉진을 위한 친환경제제로서의 높은 활용가능성을 보유하고 있는 것으로 판단된다.

Acknowledgments

The research was supported by a grant from 2017 Subsidy for overseas dispatch research of Andong National University.

NOTES

Conflicts of Interest

No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

Fig. 1

In vitro screening of antagonistic activity of rhizosphere soil bacteria. (A) Antagonistic activity of rhizosphere bacteria against Cylin- drocarpon destructans causes ginseng root rot. Red arrow shows antifungal activity of strain YGB36. (B-F) Antifungal activities of YGB36 against Collectotrichum acutatum KACC42403 (B, E), Collectotrichum gloeosporioides KACC42690 (C), C. acutatum KACC40847 (D), and C. acutatum KACC42509 (F). Small photographs in panels D, E, and F show that only fungi grow

Fig. 2

Neighbor-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain YGB36 and the closely related species. Bootstrap values (expressed as percentages of 1,000 replications) greater than 50% are shown at branch points and the species names followed by the GenBank accession numbers. Scale bar=1.0 substitutions per 100 nucleotide position.

Fig. 3

Characterization of growth and antagonistic substances in Bacillus subtilis YGB36. (A, B) Growth curve of YGB36 at various incubation periods (1-7 days). (C) The ability of YGB36 on production of cellulose, protease, amylase, siderophore, and phosphate solubilization using in vitro assays. The disk at the bottom of each plates is control (brain heart infusion).

Fig. 4

Effect of YGB36 cell suspensions or culture filtrate on conidial germination of Colletotrichum acutatum. (A) Greater suppression of conidia was observed when treated with YGB36 cell suspensions in comparison with culture filtrate, while conidia germination occurred in non-treated control 48 hr after incubation at 28°C. (B) Light microscopic observations revealed that germ tube formation was observed at 40 hr by treatment with culture filtrate, and no germ tube was observed by treatment with cell suspensions, while germ tube, appressorium, and hyphae were observed at 8 hr, 32 hr, and 48 hr, respectively, in non-treated control. The experiment was carried out at least two times with three replicates per treatment. Gt, germ tube; Ap, appressorium; Hy, hyphae. Scale bars=10 µm.

Fig. 5

Suppression of disease development of anthracnose infec- tion on detached green pepper fruits by Bacillus subtilis YGB36 sus- pensions. (A) The detached fruits after wiping with alcohol were inoculated with the conidial spores of Colletotrichum acutatum, and after drying for 1 hr, the fruits were treated with bacterial suspensions under laboratory condition in square plates. Brain heart infusion was used as a control. The disease severity was was rcorded 10 days after the incubation at room temperature. Treat- ment with YGB36 suspensions showing smaller lesions in compari- son with the control. (B) The disease severity data is expressed in bar diagram.

Fig. 6

Effect of YGB36 cell suspensions on growth promotion of red pepper in comparison with the non-treated control under greenhouse conditions. (A) The red-pepper seeds after soaking in the bacterial suspensions of YGB36 were sown in the plastic trays containing garden soil for germination. The germinated seedlings were counted from 9 to 14 days and the germination percentage was calculated. Brain heart infusion was used as a control. (B) The root length of germinated seedlings were recorded and analyzed in comparison with the control. (C) Plant growth promoting effect was checked by soil drench of the seedlings with bacterial suspensions of YGB36 cell suspensions and com- pared with the control (brain heart infusion). *P<0.1, ***P<0.001.

Table 1

Screening of commercial fungicide and insecticide sensitivity test against YGB36

Products commercial name	Active substances	0.5×	1×	2×
Fungicide
Bionem	Acibenzolar-S-methyl+Mancozeb	+	+	+
Prolans	Propineb	++	++	++
Procyon	Pyraclostrobin	-	-	-
Bellis-s	Boscalid+Pyraclostrobin	-	-	-
Huronside	Fluazinam	++	++	++
Bible	Difenoconazole+Fluazinam	++	++	++
Silbaco	Tebuconazole	-	-	-
Nativo	Tebuconazole+Trifloxystrobin	-	-	-
Seongbo tanger doctor	Flquinconazole+Prochloraz manganese complex	+	+	+
Dmzikan	Fluquinconazole+Trifloxystrobin	-	-	-
Easyfalm	Chlorothalonil+Difenoconazole	+	+	++
Dandan	Chlorothalonil+Difenoconazole	-	-	-
Gasran	Copper oxychloride+Kasugamycin	++	++	+++
Butina	Iminoctadinetris (albesilate)	+	+	++
Shadow	Trifloxystrobin	-	-	-
Arimisozin	Acibenzolar-S-methyl+Chlorothalonil	++	++	++
Liberty	Bitertanol	-	-	-
Banbumdae	Streptomycin+Validamycin-A	-	+	+
Sondujuja	Pynibencarb	-	-	-
Greentongtong	Validamycin-A	-	-	-
Salimkun	Metconazole	-	-	-
Insecticide
Mospyran	Acetamiprid	-	-	-
Manjangilchi	Acetamiprid, Etofenprox	-	-	-
Remote	Bifenthrin	-	-	-
Prebaton	Chlorantraniliprole	-	-	-
Strike	Chlorfenapyr, Clothianidin	-	-	-
Seshimi	Clothianidin	-	-	-
Afarm	Emamectin benzoate	-	-	-
Cetis	Flonicamid	-	-	-
Anychung	Fulbendiamide	-	-	-
Conido	Imidacloprid	-	-	-
Falcon	Methoxyfenozide	-	-	-
Exult	Spinetoram	-	-	-
Ceres	Cypermethrin	-	-	-
Tachyon	Etofenprox	-	-	-

-, 0; +, 1-5 mm; ++, 6-11 mm; +++, ≥12 mm.

Table 2

Metabolic activities of Bacillus subtilis YGB36 in the Biolog GEN III microplate assay and biochemical activity in the Vitek 2 assay

Biolog (GEN III microplate)		Vitek

Substrates	Responses^a	Substrates	Responses^a
Dextrin	+	Beta-xyloxidase	+
D-Maltose	+	L-Lysine-arylamidase	-
D-Trehalose	+	L-Aspartate arylamidase	+
N-Acetyl-D-galactosamine	-	Leucine arylamidase	+
N-Acetyl neuraminic acid	-	Phenylalanine arylamidase	+
1% NaCl	+	L-Proline arylamidase	-
D-Fructose	+	Beta-galactosidase	-
3-Methyl glucose	-	L-Pyrrolydonyl-arylamidase	+
D-Serine	-	Alpha-galactosidase	+
Myo-inositol	+	Alanine arylamidase	+
Glycerol	+	Tyrosine arylamidase	+
D-Fructose-6-PO4	+	Ala-Phe-Pro arylamidase	+
Gelatin	+	Cyclodextrine	-
Glycyl-L-proline	+	D-Galactose	-
L-Alanine	+	Glycogene	-
D-Gluconic acid	+	Myo-inositol	+
D-Glucuronic acid	+	Alpha-mannosidase	-
Glucuronamide	-	Maltotriose	-
Citric acid	+	Glycine arylamidase	-
α-Keto-glutaric acid	-	D-Mannitol	-
D-Malic acid	-	D-Mannose	+
Acetic acid	+	D-Melezitose	+
Formic acid	+	N-Acetyl-D-glucosamine	-
Aztreonam	-	Palatinose	+
Minocycline	-	L-Rhamnose	-
Niaproof 4	-	Beta-glucosidase	+
Tetrazolium blue	-	Beta-mannosidase	+
Potassium tellurite	+	Phosphoryl chloline	-
Sodium bromate	+	Pyruvate	+
α-Hydroxy-butyric acid	-	Alpha-glucosidase	+

^a Responses: >60%, positive (+); 0-59%, positive (-)

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