식물

시판되고 있는 오이 종자 중 오이탄저병에 감수성으로 공시한 오이품종 정선삼척(Cucumis sativus L; cv. Jeongseonsamcheok; Dongbu Farm Hannong Co., Ltd., Seoul, Korea)을 구입하여 실험에 사용하였다. 오이 종자를 발아시키기 위하여 Petri-dish에 filter paper (diameter 90 mm)를 넣고 멸균수 3 ml로 습윤 처리한 후 오이 종자를 넣고 25°C에서 24시간 동안 암배양하였다. 최아된 오이 종자를 시판되는 원예용 상토(Tuksimi^®; NongwoogreenTec., Suwon, Korea)가 채워진 플라스틱 포트(diameter 8 cm)에 파종하고 주간 25캜±1캜, 야간 18캜±1캜, 광주기 12:12가 유지되는 식물 배양실에서 재배하였으며 정식 후 10일 후인 제1엽이 완전히 전개된 직후의 식물에서 유사한 면적의 제1엽을 채취하여 실험재료로 사용하였다.

조류

Chlorella fusca CHK0059 균주를 국립농업과학원으로부터 분양 받아 실험에 사용하였다. 이 조류를 배양하기 위해서 Bold’s basal 배지(Thompson 등, 1988)와 BG11배지(Anderson, 2005; Stanier 등, 1971)의 질소원과 탄소원, 미량원소를 적절히 조화시켜 변형한 BGMM (BG11 Modified Medium)을 Kim 등(2014a)의 방법에 따라 작성하였다. C. fusca를 5% BGMM 고체배지에 3단 분리법으로 접종하여 28°C에서 5일간 배양하여 순수 분리하였다. 배양된 단일 균총을 기포발생기(SH-A2; Chosion Electric Appliance Factory, Beijing, China)가 설치된 배양용기에 담긴 BGMM 5%를 첨가한 액체배지에 재접종한 후 28°C, 5,000 lux에서 7일간 배양하였다. 클로렐라 처리를 위해서 hemocytometer (Hausser Scientific Inc., Horsham, PA, USA)를 이용하여 세포 수를 1.0–10⁷ cells/ml로 조정하였다. 준비된 현탁액에 Tween 20을 0.01%의 농도로 첨가한 후 분무기(Aervoe Industries Inc., Gardnerville, NV, USA)를 이용하여 오이 식물에 처리하였다.

병원균

오이에 탄저병을 일으키는 C. orbiculare 균주를 potato dextrose agar (PDA; Becton, Dickson and Company, Claix, France) 배지에 접종하고, 배양기(DA-MIL-2500; DONG-A, Siheung, Korea)로 옮겨 25캜에서 10일간 배양하였다. 분생자층(acervuli)이 형성된 탄저병균의 plate에 멸균수 10 ml를 넣고 loop를 이용하여 포자현탁액을 작성하였다. 포자현탁액은 miracloth (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA, USA)로 여과하여 균사를 제거한 후 hemocytometer를 이용하여 포자 농도를 1.0–10⁵ conidia/ml로 조정하여 사용하였다. 식물에 접종을 하기 위해서는 병원균이 오이 잎에 잘 부착되도록 포자현탁액에 Tween 20을 0.01%의 농도로 첨가한 후 분무기를 이용하여 접종하였다.

C. fusca 전처리와 C. orbiculare 접종

실내실험을 통해 C. orbiculare에 대한 직접적인 항균활성이 확인된 C. fusca가 오이식물에서도 오이탄저병 발생을 억제하는지 여부를 확인하기 위해 in vivo 실험을 실시하였다. C. fusca 현탁액의 농도를 2.0–10⁵, 2.0–10⁶, 2.0–10⁷ cells/ml로 조정한 후 준비된 오이식물 엽면에 분무 살포하였다. 이 조류를 처리한 오이식물체를 상온에서 5시간 동안 건조시킨 후 C. orbiculare 현탁액(1.0–10⁵ conidia/ml)을 분무하여 접종하였다. C. orbiculare가 접종된 오이식물을 상대습도 99%가 유지되는 항온항습기(DA-DC; DONG-A)에서 28°C, 24시간 동안 보관한 후 주간 25캜±1캜, 야간 18캜±1캜가 유지되는 식물 배양실로 옮기고 10일 동안 병 발생 여부를 관찰하였다. 한편, C. fusca의 오이탄저병 발생 억제 정도를 보다 정확하게 측정하기 위하여 C. fusca 현탁액 대신 살균수 그리고 시판 중인 benzimidazole계 살균제인 Benomyl^® (a.i. 50%, WP; Agrotech, Seoul, Korea)을 0.7 g/l 농도로 각각 처리하였다. 병 발생정도는 병원균 접종 10일 후에 병반수를 계수하여 측정하였다. 실험은 2주일 간격으로 총 3번을 실시하였다. 각 실험마다 처리구당 5개의 식물을 반복하여 15개의 식물체를 사용하였다.

C. orbiculare의 감염구조 관찰

C. fusca에 의한 C. orbiculare의 감염 억제 여부을 알아보기 위해 C. orbiculare의 감염구조를 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 살균수, C. fusca, Benomyl^®을 전처리하고 C. orbiculare를 접종한 후 1, 3, 5일 간격으로 오이 잎을 채취하여 Jeun 등(2000)이 보고한 방법에 따라 시료를 작성하였다.

오이탄저병에 감염된 오이 잎의 병반 부위(diameter 9 mm)를 채취하여 2% glutaraldehyde를 포함한 0.05 M phosphate buffer (pH 7.2)에 2시간 동안 고정한 후 동일한 phosphate buffer로 10분 동안 각각 3회 세척하였다. 오이탄저병균의 세포벽을 염색하기 위해 0.2% diethanol (UVtex-2B; Polysciences Europe GmbH, Muellheim, Germany)을 포함한 phosphate buffer에 20분 동안 염색하고 phosphate buffer로 10분 동안 3회 세척하였다. 염색을 마친 식물조직을 slide glass로 올려놓고 70% glycerol을 한 방울 떨어뜨린 후 cover glass로 mounting하였다. 각 시료들은 형광 필터(exciter filter, BP 400-440; interference beam splitter, FT 460; barrier filter, LP 470)가 갖추어진 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 C. orbiculare의 감염구조를 관찰하였고 병원균의 포자, 발아관 그리고 부착기를 계수하였고 관찰된 포자수에 대한 발아율(=발아관 수/포자 수%)과 발아관에 대한 부착기 형성률(=부착기 수/발아관 수%)을 산정하였다. 실험은 2주일 간격으로 3번의 분리된 접종 실험을 실시하였으며 각 실험마다 처리구별로 오이식물 5개를 준비하였고 각 엽에서 임의로 3개 부분을 채취하여 관찰하였다.

통계분석

살균수, C. fusca, Benomyl^®을 전처리한 후 오이탄저병을 접종한 오이 잎에서 조사된 C. orbiculare의 전체 포자수, 발아된 포자수 및 형성된 부착기수의 각 처리구 평균 간의 차이에 의한 유의성 검정은 SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용한 Duncan의 다중검정방법으로 분석하였다.

오이식물체에 C. fusca 전처리에 의한 오이탄저병 발병정도 억제

C. fusca의 직접적인 항균활성이 오이탄저병 발생을 억제하는지 여부를 알아보기 위해 오이식물에 C. fusca를 처리한 잎과 처리하지 않은 잎에 C. orbiculare를 접종한 후 나타난 오이탄저병의 병반 수를 조사하였다.

무처리한 오이 잎에서의 병반 형성은 병원균 접종 후 3일째부터 작은 반점들이 조금씩 보이기 시작해 5일째부터 병반이 뚜렷하게 나타났으며 병반의 모양은 경계가 명확하지 않은 원형의 겹둥근무늬로 나타났다. 접종 10일 후 병이 진전되면서 작은 병반들의 크기가 증가되고 합쳐지면서 잎의 부정형 원형병반으로 점점 확대되었다(Fig. 1A-a).

Fig. 1

(A) Disease severity on cucumber leaves pre-treated with H₂O (a), suspension of Chlorella fusca at concentration with 2.0×10⁵ cells/ml (b), 2.0×10⁶ cells/ml (c), and 2.0×10⁷ cells/ml (d) and a commercial fungicide Benomyl^® (e) at 6 days after inoculation with anthracnose pathogen Colletotrichum orbiculare. The suspension of C. fusca were treated at 5 hours before the fungal inoculation. The concentration of C. orbiculare and the Benomyl^® (a.i. 50%, WP) were 1.8×10⁵ conidia/ml and 0.7 g/l, respectively. (B) The lesion number was counted at 10 days after inoculation with C. orbiculae. The vertical bars indicate the standard deviation of 3 replications. Different letters on the columns indicate significant differences (P<0.001) according to Duncan’s multiple range test.

C. fusca를 전처리한 오이 잎에서는 처리한 C. fusca의 농도가 높아질수록 오이탄저병의 병반 수가 감소하는 경향을 보였다. C. fusca 농도가 10⁵ cells/ml인 현탁액을 처리한 잎에서는 처리를 하지 않은 무처리 잎에 비해 병원균 접종 10일 후에 약 56% 병반 수가 감소하였다. 그러나 C. fusca 현탁액 농도가 10⁷ cells/ml 현탁액을 전처리한 잎에서는 병반 수가 더욱 감소되어 약 78%까지 감소하였다(Fig. 1A-d). 또한, 형성된 병반의 크기가 작아서 시간 경과에 따라 병반이 합쳐지는 양상은 나타나지 않았다. 따라서 C. fusca 현탁액 처리에 의해 오이탄저병의 발생이 억제됨을 알 수 있었다.

한편, C. fusca의 오이 탄저병 억제효과를 시판농약과 비교하기 위하여 benzimidazole계 Benomyl^® 수화제를 오이 잎에 동일한 방법으로 전처리한 후 형성된 병반 수를 조사하였다. 시판 농약을 전처리한 오이 잎에서 무처리구에 비해 병반 수가 77.0% 적게 나타났으며 이는 C. fusca를 10⁷ cells/ml로 처리했을 때와 유사한 억제효과가 있는 것으로 조사되었다(Fig. 1B).

조류에 의해 식물병이 억제되는 사례는 이미 보고되어 있다. 주로 해초로 불리는 바다 조류에서 항균활성을 지닌 물질이 발견되었으며 이들의 추출물에 의해 식물병이 억제되었다고 보고되었다(Kulik, 1995). 최근 보고에 따르면 건조된 클로렐라를 포도묘목에 처리하였더니 유묘기에 생육이 촉진되었으며 포도나무에 GFLV를 매개하는 Xiphinema의 개체수가 감소되었다(Bileva, 2013). 또한 엽채소나 딸기를 저장하기 전에 C. fusca와 같은 속인 C. vulgaris CHK008을 엽면처리하면 저장성이 현저하게 향상되는 것으로 보고되었다(Kim 등, 2014b). 이러한 클로렐라의 생육촉진 효과, 직접적 항균활성뿐만 아니라 식물의 방어반응인 유도저항성의 발현에 관한 연구도 진행되었다. Lee와 Ryu (2016)에 따르면 Arabidopsis에 C. fusca를 처리하고 Pseudomonas syringae pv. tomato를 접종한 후 RNA-seq를 진행한 결과 C. fusca를 처리한 Arabidopsis에서 ROS와 식물방어유전자의 발현은 C. fusca에 의해 저항성이 유도된 결과라고 보고하였다.

그러나 C. fusca에 의해 식물병 발생이 억제되는 기작에 대해서는 뚜렷하게 알려져 있지 않다. 따라서 이번연구에서는 C. fusca를 전처리하고 병원균을 접종한 오이 잎의 형태학적 변화를 형광현미경으로 관찰하였다.

C. orbiculare의 감염구조 관찰

C. fusca에 의한 오이탄저병 발생 억제 원인을 보다 정확하게 알아보기 위해 오이잎에서 C. orbiculare의 감염 부위를 접종 후 시간별로 C. orbiculare의 포자수, 발아율과 부착기 형성률을 형광현미경을 이용하여 조사하였다.

무처리한 오이 잎에 C. orbiculare를 접종한 다음 1일 후에 접종한 잎의 표면을 관찰하였더니 약 60개/시료의 C. orbiculare 포자가 관찰되었고 그 중 80% 이상이 발아되었다(Fig. 2A, 3A, B). 많은 경우 발아 직후 부착기를 형성한 포자가 많이 관찰되었고, 관찰된 전체 포자 중 35% 정도가 부착기를 형성하였다(Fig. 2A, 3C). 접종 후 3일째에는 포자수와 포자의 발아율 그리고 부착기 형성률에는 1일째에 비해 뚜렷한 차이가 없었다(Fig. 2D, 3A, B). 접종 후 5일째에도 관찰된 포자수, 포자의 발아율, 그리고 부착기 형성률에는 별다른 차이가 나타나지 않았다(Fig. 3A, Fig. 3B). 이는 병원균이 식물과 접촉한 후 포자가 발아하고 식물체에 침입하기 위한 부착기 형성이 접종 후 24시간 이내에 이루어진다고 볼 수 있다.

Fig. 2

Fluorescence microscopical observations of infection structure on the leaves of cucumber plants untreated (A, D, G), pre-treated with Chlorella fusca (B, E, H) and a commercial fungicide Benomyl^® (C, F, I) after inoculation with Colletotrichum orbiculare for 1 days (A–C), 3 days (D–F), and 5 days (G–I). The concentration of C. fusca, C. orbiculare and Benomyl^® (a.i. 50%, WP) were 1.0×10⁷ cells/ml, 1.0×10⁵ conidia/ml, and 0.7 g/l, respectively. All bars=50 μm. a, appressorium; c, conidium; cf, C. fusca; gt, germ tube; h, hyphae.

Fig. 3

Number of conidia (A), germination rate (B), and rate of appressorium formation (C) of Colletotrichum orbiculare untreated, pre-treated with Chlorella fusca and a commercial fungicide Benomyl^®. The concentration of C. fusca, C. orbiculare, and Benomyl^® (a.i. 50%, WP) were 1.0×10⁷ cells/ml, 1.0×10⁵ conidia/ml, and 0.7 g/l, respectively. The different letters represent significant differences (P<0.001) according to Duncan’s multiple range test from three independent experiments.

C. fusca를 전처리한 오이 잎의 표면에서 조사된 C. orbiculare의 포자수는 접종 후 1일째 무처리한 잎에 관찰된 포자수에 비하여 유의성 있게 감소되었다. 이러한 포자수 감소는 접종 후 3일째와 5일째에서도 유사하게 조사되었다(Fig. 3A). 미생물을 전처리한 감귤잎에 더뎅이병원균을 접종한 결과 무처리에 비해 포자수와 발아율이 감소되는 것을 형광현미경을 통해 확인하였으며 이는 미생물 처리가 식물의 접종 부위에 접종원의 밀도를 감소시킨다는 결과라고 판단된다(Kim 등, 2011). 따라서 C. fusca의 전처리에 의한 식물 접종 부위의 병원균 밀도 감소가 오이탄저병 억제의 한 원인으로 작용할 수 있다고 볼 수 있다. 이는 C. fusca의 전처리에 의한 식물 잎에서 공간적 경쟁에 의해 병원균의 밀도가 감소한 것으로 추측할 수 있지만 정확한 원인을 규명하기 위해서는 추가적인 생화학적 연구가 수행되어야 한다.

C. fusca를 처리한 잎에서 포자의 발아율은 접종 후 1일째 다소 감소하였다. 그러나 접종 후 3일째와 5일째에서는 무처리에 비해 포자 발아율은 감소되지 않았다(Fig. 3B). 따라서 C. fusca에 의한 오이탄저병의 병 억제는 포자 발아를 감소시킴으로 나타나는 현상이라고 보기는 어렵다. 그러나 일반적으로는 포자 발아를 억제하여 병발생을 효과적으로 방제할 수 있다고 알려져 있다. 예를 들면, Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens, Paenibacillus polymyxa, Pseudomonas putida 등의 미생물제제에 의해 고추탄저병의 포자 발아가 억제되었으며(Kwak 등, 2012), 옥수수 밑둥썩음병 방제를 위해 Bacillus methylotrophicus, B. amyloliquefaciens를 처리한 결과 포자 발아와 균사생장이 억제되어 약 70%의 방제가를 나타내는 것으로 보고하였다(Han 등, 2015).

C. fusca에 의한 오이탄저병 발생 억제는 병원균의 부착기 형성 억제에 의한 것으로 여겨진다. C. fusca를 전처리한 오이 잎에서 병원균 접종 후 1일째 C. orbiculare의 부착기 형성이 무처리한 잎에 비해 급격하게 감소하였으며 그 이후에도 C. fusca를 전처리한 잎에서는 C. orbiculare의 부착기를 관찰하기 어려웠다(Fig. 2B, Fig. 2E, H, 3C). 부착기는 탄저병균을 포함한 몇몇 식물병원균이 식물체를 침입하기 위해서 형성하는 균사의 한 형태로서 탄저병균과 도열병균은 부착기 내부가 멜라닌 성분으로 되어 있어 내부 팽압에 의해 식물체를 침입한다고 알려져 있다(Agrios, 2005; Howard와 Ferrari, 1989; Than 등, 2008). 이러한 병원균의 식물체 침입에 관련된 기관의 형성 감소는 직접적으로 병 발생 감소를 의미한다. B. methylotrophicus, B. amyloliquefaciens 등과 같은 길항미생물 처리에 의해 옥수수 밑둥썩음병원균의 부착기 형성이 억제되는 것으로 나타났으며(Han 등, 2015), 미생물 외에도 오배자나무에서 추출한 식물추출물을 처리하면 벼도열병의 부착기 형성률을 감소시킴으로써 벼도열병 발생을 억제하였다고 보고되었다(Ahn 등, 2005).

한편 Benomyl^®을 전처리한 오이 잎에 관찰된 포자수는 접종 후 시간에 관계없이 무처리구에 비해 유의성 있게 감소하였고(Fig. 3A) 포자 발아율도 무처리에 비해 일관성 있게 감소하였다(Fig. 3B). 또한 병원균의 부착기는 접종 후 5일째까지 거의 찾아볼 수가 없었다(Fig. 2C, Fig. 2F, I, 3C). Benomyl^®은 세포내에서 methyl 2-benzimidazole carbamate로 전환되어 세포분열을 억제함으로써 살균효과를 나타내는데(McCarroll 등, 2002), C. fusca를 전처리한 식물에서도 유사하게 부착기 형성률의 감소가 현격하게 감소하였으므로 이러한 부착기 형성억제가 오이탄저병 발생 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

C. fusca에 의한 C. orbiculare의 부착기 형성 억제 기작에 대해서는 알려진 바가 없다. 다만 C. fusca의 분비물질에 의해 C. orbiculare의 부착기 형성 능력이 저하될 가능성이 있다. 예를 들면, 동일한 속에 속하는 C. vulgaris는 생장 과정 중 지방산과 탄수화물의 혼합체인 chlorellin이라는 물질을 분비하는데 이 물질은 다른 조류와 세균에까지 독성을 나타낸다고 보고되었다(McCracken 등, 1980). 따라서 C. fusca에 의한 오이 탄저병의 발생감소는 C. fusca 전처리에 의한 C. orbiculare의 부착기 형성 억제가 결정적인 원인일 것으로 판단되지만 보다 정확한 기작을 밝히기 위해서는 추가적인 생화학적 또는 세포구조학적 연구가 필요하다고 판단된다.