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Assessment of Virulence of Raffaelea quercus-mongolicae and Raffaelea spp. Isolates by Artificial Inoculation of Quercus mongolica Logs
Res. Plant Dis. 2014;20:270-274
Published online December 15, 2014
© 2014 The Korean Society of Plant Pathology.

Su-Yeon Son, Sang-Tae Seo* and Hyung-Cheol Park

Division of Forest Diseases & Insect Pests, Korea Forest Research Institute, Seoul 130-712, Korea

Sang-Tae Seo

Tel : +82-2-961-2667
Fax: +82-2-961-2679
E-mail: stseo@forest.go.kr

Received August 12, 2014; Revised October 7, 2014; Accepted October 31, 2014.
cc This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract


The objective of this study was to evaluate the virulence of geographically different isolates of oak wilt pathogen, Raffaelea quercus-mongolicae and other Raffaelea species. In this study, mature trees of Quercus mongolica were inoculated with the various isolates of Raffaelea spp. and their virulence was evaluated by measuring the extent of sapwood discoloration resulting from the inoculation. The average length of discolored sapwood in a lateral direction was longest in the trees inoculated with the isolates from Korea (8.69 cm) followed by R. quercivora (7.51 cm) and the other Raffaelea spp. (3.35 cm). The lateral length of discolored sapwood caused by the inoculation with Korean strains varied from 4.71 to 14.90 cm indicating their differences in virulence. The area of discolored sapwood caused by the inoculation with Raffaelea spp. varied from 1.57 to 8.42 cm2 indicating their differences in virulence. Based on the length and area of the discolored sapwoods, isolated YY and wj43 appeared to have the highest virulence among all the Raffaelea isolates tested. Each of the two isolates was obtained from Gangwon Province and Jeonbuk Province, respectively.
Keywords : Inoculation, Oak wilt, Raffaelea quercus-mongolicae
서 론
참나무류는 낙엽활엽수림의 대표적인 수목으로서, 우리나라수종들 중에서 종의 점유면적 및 축적량이 상위인 10개 수종 중신갈나무, 굴참나무, 상수리나무, 졸참나무, 갈참나무 등이 포함되어 있으며, 이 5개 수종의 점유비율이 무려 63.9%에 이른다(Korea Forest Research Institute, 2012). 참나무류는 우리 주위에서 가장 흔히 볼 수 있고 쓰임새가 다양하여 귀중한 자원으로 다루어져야 할 것이다.
 현재 참나무류의 쇠퇴 및 병에 의한 고사피해가 전 세계적으로 발생되고 있으며, 집단적인 고사피해를 일으켜 문제가 되고있는 병해는 크게 3종류가 있다(Kim, 2007). 미국 및 유럽에서는 Ceratocystis fagacearum에 의한 참나무시들음병(oak wilt)과Phytophthora cinnamomi에 의한 급사병(sudden oak death)의피해가 심각한 것으로 보고되어 있으며(Brasier, 1996; Juzwik등, 2011), 일본에서는 Raffaelea quercivora에 의한 참나무류의집단고사가 발생하여 문제가 되고 있다(Kusumoto 등, 2012;Kubono와 Ito, 2002; Murata 등, 2005; 2007).
 우리나라에서는 2004년 경기도 일원에서 참나무류 집단 고사현상이 처음 발견되었고, 국내 전역에 걸쳐 빠르게 확산되어2007년도에는 경기도, 강원도, 전라북도의 천공목율이 가장 높게 나타났으며, 이후 다양한 연구에 의해서 병원균은 R. quercusmongolicae로최종적으로 동정되었다(Kim, 2009; Korea ForestResearch Institute, 2010). 참나무시들음병은 광릉긴나무좀(Platypus koryoensis)과 Raffaelea sp.와의 공생관계에 의해 발생하며(Korea Forest Research Institute, 2007; 2010), 이러한 메커니즘은 일본의 참나무시들음병과 유사하다(Hong 등, 2006).일본에서는 병원성을 검정하는 연구가 다양하게 진행되고있고(Murata 등, 2005; 2007), 국내 또한 병원성 검정을 시도하고 있으나 병원성 검정이 효과적으로 나타나지 않았다(KoreaForest Research Institute, 2010; Torii 등, 2014).
 이 연구는 병원성 검정연구에 앞서 균주간의 참나무시들음병 병원성을 간접적으로 확인하기 위하여 감수성이 높은 신갈나무에 R. quercus-mongolicae Raffaelea spp.를 접종하고, 목재 내의 균사 생장으로 인해 생성된 변색 부위의 크기 및 면적을 비교 분석하였다.
재료 및 방법
공시균주.? 본 연구에서는 국내균주 R. quercus-mongolicae12개와 국내 및 국외의 Raffaelea spp. 10균주를 사용하였다(Table 1). 각각의 균주들은 25oC 암 조건에서 7일간 PDA 배지(potato dextrose agar, Difco Co.)에 배양하였으며, 균이 자란 배지를 멸균 핀셋으로 으깨서 1.5 ml tube에 옮겨 담은 뒤 다시 일주일을 배양하였고, 배양된 균주는 접종원으로 인공접종에 사용하였다.

병원균의 인공접종.? 2013년 5월 15일 강원도 춘천시 소재의 신갈나무 임지에서 흉고 직경이 26 cm이고 광릉긴나무좀의침입공 흔적이 없는 신갈나무 3그루를 선발하여 벌목하였으며,접종 및 보관에 용이하도록 1 m 길이로 단목별 2개씩 제재하였다. 절단된 신갈나무는 70% 알코올로 표면살균을 한 뒤 줄기내의 수분이 손실되지 않도록 양쪽 단면을 바셀린(Vaseline)으로 처리하였다. 그 후 Murata 등(2005)이 접종에 사용한 방법을응용하여 절단된 단면으로부터 10 cm 위를 접종 시작점으로 20 cm 간격으로 접종을 하였으며, 접종 라인 당 일정한 간격으로 6개씩 일정한 간격을 두고 총 30개의 접종구(직경 0.8 cm,깊이 2 cm)를 제작하였다. 또한 각 줄기 둘레의 접종구는 생장이 겹치지 않도록 어긋나게 하였다(Fig. 1). 각 간격의 6개 접종원 중 1개씩은 대조구(control)로 선정하여 PDA 배지를 접종하였으며, 나머지 5개의 접종구에는 각각의 균주들을 0.8 g 씩 접종하였다. 수분 유지 및 오염을 방지하기 위하여 멸균된 8 mmPaper disc에 멸균수를 흡수시킨 뒤, 접종구에 삽입하고 바셀린으로 처리하였다. 접종 후에는 통나무 전체를 랩을 이용하여 밀봉하고 미리 제작된 아크릴 케이지(직경 30 cm, 높이 1.2 m)에넣어 밀폐시킨 후 항온실에서 25oC, 암 조건으로 5주 동안 배양하였다. 실험은 접종 대상목의 생장 상태에 따라 균 생장의 편차가 다를 것을 대비하여 3반복으로 진행 하였다.

변색부위의 측정 및 통계분석.? 항온실에서 5주간 배양시킨 절단된 신갈나무 줄기는 각 20 cm 간격의 접종부위를 목공기계 띠톱 제재기(Holytex Co. SBW-5300)를 이용하여 절단하였으며, 절단면의 사진을 촬영하고 ImageJ 1.48v program (http://rsb.info.nih.gov/ij/)을 이용하여 형성층을 기준으로 변색된 측면의 길이와 변색된 부위의 면적을 측정하였다(Fig. 1Fig. 2).그리고 병원균들이 수목에 미친 일반적 특성을 통계분석프로그램 SAS(SAS 9.4, SAS Institute Inc., USA)를 이용하여 Tukey’sStudentized Range(HSD) test를 통하여 사후검정 분석하였다.
결과 및 고찰
Raffaelea quercus-mongolicaeRaffaelea spp.를 신갈나무 줄기에 인공접종하여 5주 경과 후 변색된 접종 부위의 측면 길이를 ImageJ 1.48v program을 이용하여 측정하고 SAS로 Tukey’s Grouping을 한 결과, Table 2와 같이 신갈나무에 대하여 각 균주들이 유의한 차가 있는 것으로 나타났다. 각 균주별에 따라 변색부위의 길이에 차이가 있었는데(F = 6.47, p =0.0001) wj43(전라북도)이 14.90 cm로 변색부위가 가장 크게나타났고, CBS 185.64(R. ambrosia)는 1.64 cm로 가장 낮게 나타났다. Tukey 사후 검정결과 Control, gh09(충청남도), CBS168.66(R. canadensis), CBS 185.64(R. ambrosia) 균주는 wj43(전라북도) 균주와 YY(강원도) 균주와 병원성 차이가 있는 것으로나타났으며, 나머지 균주들은 차이가 거의 없는 것으로 나타났다(Table 2).
 각 균주에 따라 변색부위의 면적 또한 차이가 있었는데(F = 7.02, p = 0.0001) wj43(전라북도)이 8.42 cm2로 변색면적 값이 가장 컸으며, CBS 185.64(R. ambrosia)는 1.57 cm2로가장 면적이 작게 나타났다. Tukey 사후 검정결과 Control과CBS 185.64(R. ambrosia), CBS 271.70(R. albimanens) 균주는RA410920, YY(강원도), wj43(전라북도), RQ9.7102(경상북도),hc0903(경상남도) 균주들과 병원성 차이가 있는 것으로 나타났으며, 나머지 균주들은 차이가 거의 없는 것으로 나타났다(Table 2).
 변색된 측면의 총 평균 길이 값은 국내에서 분리된 R. quercusmongolicae균주들이 8.69 cm로 7.51 cm인 일본 균주와 3.35 cm인 기타 Raffaelea 속 근연종 균주의 평균 길이 값보다 컸으며,변색된 면적의 총 평균값은 일본 균주들이 5.97 cm2를 나타내어 기타 Raffaelea 속 근연종 균주 1.79 cm2와 국내에서 분리된균주 5.57 cm2보다 높은 값을 나타냈다.
 이와 같이 접종 그룹 별로 변색 길이와 면적의 총 평균값이 서로 비례하지 않는 이유는 일본 균주들의 측면 변색 값과 변재부변색 면적 값 비율보다 국내 R. quercus-mongolicae 균주들 값의비율 차가 더 크기 때문이다. 이와 같이 각 균주들의 길이와 면적 값이 비례하지 않는 결과는 Murata 등(2007)이 6종의 참나무류 수종에 R. quercivora를 접종한 실험의 결과와 일치하며, Q.serrata 줄기에 R. quercivora 5개를 접종했을 때 각기 변색 길이가 다르게 나타난 Kusumoto 등(2012)의 보고와도 일치하였다.또한 Korea Forest Research Institute(2010)에서 일본균주와 한국균주를 각각 3개씩 선택하여 접종 후 관찰한 결과 일본과 한국 균주간의 균주별 변색크기의 차이가 다르게 나타난 결과와도 일치 하였다. 한편 변색된 부위에서 접종균을 재분리 한 결과 분리율이 100% 였으며, Control 변색부위에서는 Raffaelea가 분리되지 않았다. 이는 Torii 등(2014)이 접종 후 재분리 결과Control에서 Phomopsis spp.와 Trichoderma spp.가 분리 되었으며, R. quercus-mongolicae가 분리되지 않은 결과와 일치하였다.
 본 연구에서는 국내에서 분리된 균주들 중에서 YY(강원도),wj43(전라북도), RQ9.7102(경상북도), hc0903(경상남도) 균주가 길이 값이 8 cm 이상이면서 면적 값이 6 cm2로 가장 많은 변색을 보여 다른 지역들의 분리 균주들보다 병원성이 더 높은 것으로 사료된다. 한편 YY와 wj43 균주는 Seo 등(2010)이 보고한지역별 Raffaelea spp.의 유전적 분류 실험에서 같은 그룹에 속해 있었는데, 본 실험에서도 변색길이와 변색면적의 Tukey 검정을 통하여 YY와 wj43가 다른 균주들과 차이가 있었고 병원성또한 가장 높게 나타났다. 하지만 hc0903의 경우 유전적으로다른 그룹에 있으므로 이는 Tukey 검정에서 길이의 그룹과 면적의 그룹이 일치하지 않아 차이가 있는 것으로 사료된다.
 정확한 유연관계를 얻기 위해서는 계속해서 유전적 연구와병원성 검정 연구가 함께 이루어져야 하고, 병원성 검정을 할때 상대적으로 변색이 많이 된 병원균을 이용하면 보다 좋은 결과를 얻을 수 있을 것이라 사료되며, 더 정확한 병원성 검정 연구를 위해서는 야외의 입목에 접종하여 시들음 정도와 줄기의막힘 정도를 비교분석하는 연구가 필요할 것이다.
요 약
본 연구의 목적은 신갈나무에서 참나무시들음병 병원균인Raffaelea quercus-mongolicae의 지역별 균주와 기타 Raffaelea속 근연종의 병원성을 평가하는 것이다. 이 연구에서는 신갈나무에 다양한 균주를 접종한 후, 변재부 내 변색정도로 각 균주의 병원성을 판단하였다. 그 결과 변색부의 평균 측면 확산정도는 국내에서 분리한 Raffaelea quercus-mongolicae 병원균(8.69 cm)이 일본 병원균(7.51 cm)이나 기타 Raffaelea 속 근연종(3.35 cm)의 평균보다 높았고, 국내 지역별 Raffaelea quercusmongolicae균주간에는 변색부 측면 확산정도가 4.71-14.90 cm로 병원성의 차이를 보였다. 균주간의 변색부 면적 확산정도는 1.57-8.42 cm2로 서로 다른 병원성의 차이를 보였으며, 가장높은 병원성은 강원도에서 분리한 YY와 전라북도에서 분리한wj43에서 나타났다.
Figures
Fig. 1. Schemes for log inoculation (A) and sapwood discoloration measurement (B).
Fig. 2.  Discolored sapwood on a Q. Mongolica cross-section five weeksafter inoculation with Raffaelea quercus-mongolicae, other Raffaeleaspp., and control.
Tables
Table. 1. Raffaelea sp. isolates used in this study

Table. 2. Average lateral length and average area of discolored sapwood by inoculum (p < 0.0001, F = 6.47)
*Tukey’s Studentized Range (HSD) test at the significant level of a = 0.05. 
↔: significantly different in post-hoc tests.

References
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