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Biological Control of Fusarium Stalk Rot of Maize Using Bacillus spp
Research in Plant Disease 2015;21:280-289
Published online December 31, 2015
© 2015 The Korean Society of Plant Pathology.

Joon-Hee Han, Gi-Chang Park, Joon-Oh Kim, and Kyoung Su Kim*

Division of Bioresource Sciences, College of Agriculture and Life Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea
Tel : +82-33-250-6435 Fax: +82-33-259-5558 E-mail: kims@kangwon.ac.kr
Received September 23, 2015; Revised November 4, 2015; Accepted November 9, 2015.
cc This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

요약

옥수수는 세계적으로 가장 중요한 작물이다. 옥수수의 소비가 꾸준히 증가하고 있지만, 생산량은 연작과 Fusarium spp.와 같은 토양전염성 곰팡이병의 감염에 의해 줄어들고 있다. 최근에 우리나라를 포함해 전 세계적으로 F. subglutinansF. temperatum에 의해 발생되는 옥수수 밑둥썩음병의 발생이 많이 보고되고 있다. 본 연구에서는 병에 걸리지 않은 건전한 옥수수 토양 근권에서 F. subglutinansF. temperatum에 대치배양을 통해 항균활성을 보이는 3 균주(GC02, GC07, GC08)를 선발하였다. 선발된 3 균주 중 GC02와 GC07이 균사생장을 효과적으로 억제하였다. 그리고 16s rRNA에 기반하여 분석한 결과, GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B. amyloliquefaciens 그리고 GC08은 B. thuringiensis로 동정되었다. 또한, GC02와 GC07은 포자발아의 억제에도 효과적이었다. 3개의 Bacillus 균주들은 모두 protease의 활성이 강하게 나타났으며, cellulase 활성은 GC07과 GC08에서만 나타났다. 그리고 불용성 인산의 가용화와 siderophore의 생산은 GC02와 GC07이 비교적 GC08에 비해 우수한 것으로 나타났다. 옥수수 줄기에 2개의 Fusarium과 접종하여 발병억제효과를 검정한 결과 B. amyloliquefaciens GC07이 가장 효과적인 방제효과를 나타내었다. 또한 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 다른 식물병원성 진균들도 효과적으로 균사생장을 억제하였다. 따라서, B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 식물병원성 진균방제에 생물학적 방제제로서 역할이 가능하다고 판단된다.

Maize (Zea mays L.) is an economically important crop in worldwide. While the consumption of the maize is steadily increasing, the yield is decreasing due to continuous mono-cultivation and infection of soil-borne fungal pathogens such as Fusarium species. Recently, stalk rot disease in maize, caused by F. subglutinans and F. temperatum has been reported in Korea. In this study, we isolated bacterial isolates in rhizosphere soil of maize and subsequently tested for antagonistic activities against F. subglutinans and F. temperatum. A total of 1,357 bacterial strains were isolated from rhizosphere. Among them three bacterial isolates (GC02, GC07, GC08) were selected, based on antagonistic effects against Fusarium species. The isolates GC02 and GC07 were most efficient in inhibiting the mycelium growth of the pathogens. The three isolates GC02, GC07 and GC08 were identified as Bacillus methylotrophicus, B. amyloliquefaciens and B. thuringiensis using 16S rRNA sequence analysis, respectively. GC02 and GC07 bacterial suspensions were able to suppress over 80% conidial germination of the pathogens. GC02, GC07 and GC08 were capable of producing large quantities of protease enzymes, whereas the isolates GC07 and GC08 produced cellulase enzymes. The isolates GC02 and GC07 were more efficient in phosphate solubilization and siderophore production than GC08. Analysis of disease suppression revealed that GC07 was most effective in suppressing the disease development of stalk rot. It was also found that B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 have an ability to inhibit the growth of other plant pathogenic fungi. This study indicated B. methylotrophicus GC02 and B. amyloliquefaciens GC07 has potential for being used for the development of a biological control agent.

Keywords : Bacillus spp, Biological control, Fusarium spp, Maize, Stalk rot
서론

옥수수(Zea mays L.)는 세계 3대 식량작물에 속하며 재배 면적당 수량성이 뛰어나 전 세계적으로 중요한 식량자원이다 (Varshney 등, 2012). 최근에는 식량 및 사료 외에도 시약, 화장품, 도료, 인쇄, 제지업 등의 산업원료로 사용되며, 미국 등 선진 국에서 친환경에너지 개발에 따른 바이오 에탄올 연료로의 사용이 매년 증가하여 옥수수의 가치가 높아지고 안정적인 생산이 중요해 지고 있다(Hertel 등, 2010; Kim 등, 2002). 그러나 옥수수의 수요가 증가함에 따라 대량생산과 단일재배에 의한 연작으로 병충해에 의한 피해가 증가하고 있는 실정이다(Lobell 등, 2009; Oerke, 2006).

옥수수에는 많은 종류의 병해가 발생하고 있으며, 한국식물병목록(2004)에 의하면 국내에 발생하는 진균병은 Exserohilum turcicum에 의한 매문병(Northern leaf blight), Cochliobolus heterostrophus에 의한 깨씨무늬병(Southern leaf blight), Ustilago zeae에 의한 깜부기병(Smut), Puccinia sorghi에 의한 녹병(Rust) 등 13종이 보고되었다. 이 중에서 Fusarium spp.에 의한 병해는 F. moniliforme에 의한 밑둥썩음병(stalk rot), Gibberella fujikuroi에 의한 이삭썩음병(ear rot), G. zeae에 의한 붉은곰팡이병 (Gibberella stalk rot)이 보고되어 있다.

Fusarium spp.는 1,000개 이상의 종으로 분류되는 거대한 속 이다(Watanabe 등, 2011). 이 중에서 과거에 F. moniliforme로 알려진 Gibberella fujikuroi 종복합체는 Fusarium spp.를 불완전 세대로 하는 자낭균의 사상성 곰팡이집단으로 여러 가지 종이 혼재하는 종복합체(species complex)로 밝혀져 옥수수뿐만 아니라 벼, 수수, 기장 등 광범위한 기주식물을 가지며 심각한 피해를 입히고 있다(Nirenberg와 O’Donnell, 1998). 이에 근거하여 본 연구진은 2013년부터 2014년 동안 국내 옥수수 생육 초기 단계에 발생하여 수확량 감소 등의 문제를 일으킨 밑둥썩음병을 조사하여 형태학적 분석 및 EF1a 지역의 염기서열 분석을 통해 동정한 결과 Gibberella fujikuroi 종복합체에 속하는 F. subglutinansF. temperatum에 의한 것이라는 것을 밝혀냈다(Shin 등, 2014b). F. subglutinans는 국, 내외에 걸쳐 과거부터 옥수수에 발생하여 많은 문제를 야기하고 비교적 연구가 많이 된 식물병원균이다(Kriek 등, 1977; Lew 등, 1996). 그러 나 F. temperatumF. subglutianans와 유사하지만 또 다른 종으로서 유럽의 벨기에(Scauflaire 등, 2012), 스페인(Varela 등, 2013), 인근의 중국(Wang 등, 2014) 그리고 남미의 아르헨티나 (Fumero 등, 2015) 등 최근 들어 전 세계적으로 보고되고 있다. 이 두 병원균은 옥수수 생육 전반에 걸쳐 뿌리, 줄기, 이삭 등에 썩음병을 일으키는 주요 병원성 진균으로 옥수수의 품질과 수량을 저하시켜 옥수수 생산량에 큰 피해를 주고 있다. 또한 fumonisin, moniliformin, beauvericin, fusaproliferin, fusaric acid 등의 진균독소를 생성하여 심각한 피해를 초래한다(Lew 등, 1996; Scauflaire 등, 2012).

그러나 아직까지 국내 옥수수에 발생하는 병해의 방제를 위한 연구는 전무한 실정으로 국내에 등록된 살균제는 깜부기병 약제 2종뿐이다(Shin 등, 2014a). 이와 더불어 최근에 먹거리 안전성과 친환경에 대한 관심의 증가로 길항미생물을 이용한 생물학적 방제에 대한 연구가 활발히 이루어지고 친환경 농산물의 소비 또한 증가하고 있다. Fusarium spp.를 방제하기 위한 길항미생물에 대한 연구로 F. oxysporum을 방제하기 위하여 Psedomonas sp.(Lemanceau와 Alabouvette, 1991), Trichoderma harzianum(Sivan 등, 1987) 등이 보고되었다. 최근에는 F. graminearum를 방제하기 위하여 itrurin을 생산하는 B. amyloliquefaciens(Crane 등, 2013)를 이용하거나, F. verticillioides를 방제하기 위하여 fumonisin B1생산을 억제하는 B. subtilis(Cavaglieri 등, 2005) 등이 보고되고 있다. 그러나 최근 발생빈도가 증가하는 F. subglutinansF. temperatum에 대한 길항미생물을 이용한 생물학적 방제에 대한 연구는 전무한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 병이 발생하지 않은 건전한 옥수수 포장에서 미생물을 분리하여 F. subglutinansF. temperatum에 항균활성을 보이는 길항미생물을 동정하고 조사함으로써 옥수수 밑둥썩음병을 방제할 수 있는 생물학적 방제제로의 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

미생물 분리 및 병원균 준비

항균활성을 보이는 토양미생물을 분리하기 위하여 병이 발생하지 않은 강원도 홍천 지역의 옥수수 재배지에서 토양시료를 채취하였다. 시료에서 길항 미생물의 분리를 위하여 토양 1 g과 생리식염수(NaCl 0.85%) 9 ml을 섞고 1.5 ml tube에 10-3-10-5의 농도로 희석하여 LBagar(Duchefa, 네덜란드) 배지에 도말하고 28°C에서 1일 동안 배양하였다. 배양 이후 단일콜로니를 분리하여 순수 분리하였다. 분리된 균주들은 20% glycerol에 현탁하고 -70°C deep freezer에 보관하였다.

본 연구에서 사용한 옥수수 밑둥썩음병은 이전 연구(Shin 등, 2014b)에서 분리 및 동정된 F. subglutinans(KWF-17)와 F. temperatum(KWF-14)을 사용하였다. 병원균의 보관을 위하여 PDA(MB cell, South Korea) 배지에 각각 접종하여 25°C 배양기에서 10일간 배양하였다. 포자가 자란 배지에 멸균수를 첨가하고 표면을 긁어 포자현탁액을 얻어내고, 20% glycerol로 포자현탁액을 만들어 -70°C에 보관하였다.

균사생장억제효과 검정

옥수수 밑둥썩음병원균 2종에 대하여 길항미생물의 항균활성을 갖는지 알아보기 위하여 대치배양을 통한 균사생장 억제효과를 검정하였다. 길항미생물의 배양은 LB-broth(Duchefa, Netherlands) 배지에 28°C, 200 rpm으로 24시간 진탕 배양하였다. 대치배양을 위하여 LPA(LB 50%+PDA 50%) 배지를 만들어 4 mm 직경의 병원균 agar plug를 한 가운데 접종하였다. 그리고 주변 3곳에 cork borer를 이용하여 4 mm 직경의 구멍을 내었다. 이후에 배양한 길항미생물은 O.D값 1.0으로 조정한 후에 20 ml씩 구멍에 접종하였다. 병원균과 길항미생물이 접종된 LPA 배지는 25°C 배양기에서 7일 동안 빛을 차단하여 배양하였으며, 길항미생물이 균사생장을 억제한 거리를 3반복으로 3차례 시험하여 측정하였다.

발아율 억제 검정

병원균 포자에서 발아가 억제되는지 알아보기 위하여 병원균을 PDA 배지에 접종하여 포자 형성을 유도하였다. 배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판 (hemocytometer)을 이용하여 1×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다. 그리고 길항미생물을 배양하여 O.D 값 1.0으로 조정한 후, 포자 현탁액에 각각 10배, 100배, 1000배로 희석한 길항미생물을 넣어 주었다. 그리고 포자발아를 유도하기 위하여 소수성 표면의 slide glass 위에 올려놓고 25°C에서 습실 처리하여 배양하였고 8시간 후에 포자의 발아율을 측정하였다. 포자 발아율은 (1-발아율/무처리구 발아율)×100으로 3반복으로 3차례 시험하여 계산하였다.

효소활성 분석

Cellulase 활성을 알아보기 위해 CMC agar 배지를 Sazci 등(1986)에서 사용한 방법을 사용하였으며, 만든 배지에 cork borer를 이용하여 직경 4 mm의 구멍을 뚫어, O.D 값 1.0으로 맞춘 20 ml의 길항미생물 배양액을 접종하여 25°C 에서 3일간 배양하였다. 그리고 petridish에서 배지를 꺼내어 0.1% congo red 용액에 15-20분 동안 배지를 담가 염색하고, 1M NaCl 용액에 15-20분 동안 배지를 담가두고 탈색시켜 clear zone 형성을 관찰하여 cellulase 활성을 검정하였다.

Proteolytic 활성을 알아보기 위해 3% skim milk powder가 첨가된 LB 배지를 만들어 위와 같은 방법으로 세균을 접종하고 3일간 배양한 뒤, clear zone 형성을 관찰하여 protease 활성을 검정하였다.

Siderophore 활성을 알아보기 위해 간단하게 변형된 CAS (Chrome Azurol Sulfonate) assay를 사용하였다. CAS(sigma, USA) 염료용액은 증류수 50 ml에 CAS 60.5 mg을 녹이고, 72.9 mg의 HDTMA를 증류수 40 ml에 녹여 빛이 들어가지 않도록 하였다. 그리고 LB agar 35 g을 증류수 900 ml에 녹여 세 가지 용액을 혼합하고 고압 멸균하였다. 이 후에 pH 6.8로 조정하기 위한 HCl 용액(10 mM) 10 ml에 1 mM FeCl3 · 6H2O를 녹여 따로 고압 멸균하였다. 고압 멸균된 두 용액을 50°C로 식힌 후 천천히 거품이 나지 않도록 섞어주고 petridish에 분주하여 CAS 평판배지를 만들었다. 이 후 위와 같은 방법으로 세균을 접종하고 25°C에서 5일간 배양한 후 clear zone 형성 유무를 관찰하여 siderophore 생산 여부를 판단하였다.

길항미생물이 난용성 인산염을 분해할 수 있는지 알아보기 위하여 불용성 인산이 포함된 Pikovskaya’s agar 배지를 이용하여 활성 검정을 하였다. 본 배지는 Gaind와 Gaur(1991)의 방법으로 만들었으며, 위와 같은 방법으로 세균 배양액을 접종하였다. 25°C에서 15일간 배양한 후 clear zone 형성 유무로 인산가용 활성을 검정하였다.

옥수수를 이용한 방제효과검정

길항미생물을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병원균에 대한 방제효과를 알아보기 위하여 3-4주 정도 키운 옥수수(미백) 줄기의 아래 부분을 잘라내어 사용하였다. 병원균은 PDA 배지에 접종하여 포자 형성을 유도하였다. 배양 10일 후에 포자 현탁액을 얻어 혈구계산판을 이용 하여 4×104 conidia/ml의 농도로 맞추었다. 각 길항미생물은 LB broth에서 16시간 배양하고 O.D값 1.0으로 맞추어 준비하였다. 준비된 포자현탁액과 길항미생물을 각각 20 ?l씩 잘라낸 줄기 한쪽부분에 피펫을 이용하여 주입하였으며 발병을 유도하였다. 그리고 10일 후에 발병도를 측정하였다. 발병도는 줄기에 전반된 병징의 크기에 따라 0에서 4까지 disease index로 분류하여 0은 0%, 1은 1-25%, 2는 26-50%, 3은 51-75%, 4는 76- 100% 나타내며, 각각에 대해서 3반복으로 3차례 시험하였다. 방제가는 (무처리구발병도-처리구발병도)/무처리구발병도× 100의 계산식에 의해 계산하였다.

길항미생물의 동정

길항미생물의 chromosomal DNA 추출은 3 ml의 LB 배지에서 16시간 동안 배양시킨 배양액으로 Wizard genomic DNA purification kit(Promega, USA)의 방법에 따라 추출하였다. 16s rRNA 부분의 증폭을 위하여 universal primer인 27F와 1492R primer를 이용하였다. PCR은 2720 Thermal Cycler(Applied Biosystems, UK)를 사용하여 98°C에서 10초의 denaturation 후 98°C에서 10초, 55°C에서 30초, 72°C에서 1분 과정을 35회 반복한 후 마지막으로 72°C에서 7분간 반응시켰다. PCR 산물은 1×TAE(Tris-acetate-EDTA) buffer를 이용하여 1% agarose gel에서 30분간 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV-transilluminator에서 밴드를 확인하였다. 확인된 밴드는 MEGA-spin™ Agarose Gel Extraction Kit(Intron, Korea) 의 방법에 따라 정제한 후 염기서열 분석을 위해 시퀀싱 분석 서비스(Macrogen, South Korea)를 이용하였다. 분석된 염기서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 BLASTN 프로그램을 이용하여 분석하였다. 염기서열 비교를 위해, MEGA 6의 ClusterW를 이용하여 염기서열을 정렬하였으며, 1,000 bootstrap으로 neighbor-joining 방법을 이용하여 phylogenetic tree를 완성하였다.

통계분석

길항미생물 처리를 통한 병원균의 균사생장과 발아율 억제 그리고 옥수수 줄기를 이용한 방제효과검정의 각 처리구 평균간의 차이에 의한 유의성 검정은 SAS 9.3(SAS Institute Inc, USA)을 이용한 Duncan의 다중검정방법(Duncan’s multiple range test)으로 5% 수준에서 통계 분석하였다.

결과 및 고찰

길항미생물의 선발 및 동정

강원도 홍천에 위치한 옥수수 밑둥썩음병이 발생하지 않은 건전한 옥수수 포장에서 토양시료를 채취하여 미생물들을 분리하였다. 분리된 미생물들은 밑둥썩음병원균 2종(F. subglutinas, F. temperatum)과 대치배양을 통해 항균활성을 보이는 길항미생물을 선발하였다(Fig. 1A). 분리된 식물근권미생물 1,357개 중 서로 다른 모양의 콜로니 20개를 선발하고 대치배양한 결과 3개의 균주가 항균활성을 나타내었으며, 그 중 가장 효과가 좋은 GC02는 F. subglutinansF. temperatum에 대하여 각각 11.7 mm와 10.7 mm의 균사생장을 억제하였다. 그리고 GC07은 각각 11.3 mm와 10.3 mm의 균사생장을 억제하였으며, GC08은 4.7 mm와 2.0 mm로 GC02 와 GC07에 비해 약한 억제효과를 보이는 것으로 나타났다(Fig. 1B). 항균활성을 보인 3개의 길항미생물들에 대해서 16s rRNA 염기서열 분석을 통한 분류 및 동정을 진행한 결과 GC02는 Bacillus methylotrophicus, GC07은 B. amyloliquefaciens, 그리고 GC08은 B. thuringiensis로 분류되었다(Fig. 2).

Fig. 1.

Inhibition of mycelium growth of Fusarium subglutinans and F. temperatum by antagonistic microorganisms. (A) Dual culture assay for in vitro inhibition of mycelium growth. F. subglutinans (a-d) and F. temperatum (e-h) were cultured on PDA plates at 25oC for 7 days, then mycelium disc were cut and placed center of LPA(LB+PDA) plate. Antagonistic microorganisms were inoculated in the holes for plate. Results are shown for: a and e, GC02; b and f, GC07; c and g, GC08; d and h, control. (B) Distance of clear zone was measured after 7 days of incubation against F. subglutinans and F. temperatum on LPA medium at 25oC. Error bars represent standard deviations of three replicates. Different letters on bars indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test at p=0.05.


Fig. 2.

Phylogenetic tree based on 16s rRNA sequences of bacterial isolates. DNA sequences from the NCBI nucleotide database were aligned using the ClustalW program in MEGA 6.0, and constructed using the neighbor-joining method with 1,000 bootstrap replicates. The scale bar indicates the number of differences in nucleotide substitutions per sequences. The GenBank accession numbers of the Bacillus species most similar to the bacterial isolates were indicated in parenthesis.


옥수수 밑둥썩음병원균 2종에 항균활성을 나타낸 길항미생물은 Bacillus spp.로 동정되었다. Bacillus spp.는 간균형의 그람 양성세균으로 iturin, surfactin과 bacillomycin 등의 lipopeptide 계를 포함하여 다양한 항생물질을 분비하는 것으로 알려져 있다(Ongena와 Jacques, 2008). 그리고 B. methylotrophicus strain BC79에서 phenaminomethylacetic acid를 분비하며, 다양한 식물병원성 진균의 균사생장과 포자 발아를 억제한다고 보고 되었다(Shan 등, 2013). 그리고 인삼썩음병에 길항력이 있는 B. amyloliquefaciens GP4-1, GR2-2, GR4-5는 iturin A와 surfactin 의 생합성 유전자가 검출되었으며, GR4-5 균주는 bacillomycin D의 생합성 유전자도 추가로 검출되었다(Kim, 2012). 최근에 는 유전공학기술을 이용하여 길항미생물이 코딩하고 있는 유전자들을 재조합하여 생물학적 방제제 등의 개발을 시도하고 있다(Qiao 등, 2014). 이러한 결과는 같은 Bacillus spp. 일지라도 strain에 따라 각각 분비하는 항생물질이 다르고 항균활성의 효과가 다를 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 식물병원성 진균에 효과가 우수한 길항미생물의 탐색과 신규 항균물질에 대한 지속적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.

길항미생물의 발아억제효과 검정

옥수수 밑둥썩음병원균 2종을 비롯한 대부분의 식물병원성 곰팡이들은 발아하여 부착기를 형성하고 식물체 표면을 뚫고 들어감으로써 병을 일으킨다(Howard와 Ferrari, 1989). 따라서 선발된 길항미생물이 포자의 발아를 억제할 수 있는지 알아보았다(Fig. 3). 그 결과 B. amyloliquefaciens GC07 배양액(O.D 1.0 10배 희석)을 F. subglutinansF. temperatum에 처리하였을 때 각각 98.1%와 96.8%로 대부분 포자가 발아하지 못하였다. 그리고 100배 희석하여 처리할 경우 각각 86.3%와 81.8%의 발아억제율을 보였다. 그러나 1,000배 희석하여 처리하자 각각 42.3%와 33.8%로 발아억제율이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다. B. methylotrophicus GC02는 B. amyloliquefaciens GC07과 유사하지만 비교적 낮은 억제율을 보였다. B. thuringiensis GC08은 두 균주와 비교하여 낮은 발아억제율을 보였으며, 1,000배 희석하여 처리한 경우에는 대부분의 포자에서 발아하여 억제효과가 없는 것으로 보였다(Fig. 3).

Fig. 3.

Inhibition of conidial germination by antagonistic microorganisms. (A) Inhibition of conidial germination of Fusarium subglutinans. (B) Inhibition of conidial germination of F. temperatum. Error bars represent standard deviations over three replicates. Different letters on bars indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test at p=0.05.


최근 연구에서 길항미생물을 이용한 친환경농자재로 고추 탄저병에 대한 포자 발아의 억제력을 검정한 결과 B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Panibacillus polymyxa, Pseudomonas putida 등의 미생물제제에서 포자의 발아가 억제되었으며, B. subtilisP. polymyxa의 혼용제(Kwak, 2012 등)와 Bacillus sp. NAAS- 1(Yoo 등, 2012)에서는 부착기를 생성하지 못하는 것으로 보고 되었다. 그리고 B. subtilis YM10-20이 생산하는 iturin-like 물질로 Penicillium roqueforti의 발아가 억제되기도 하였다(Chitarra 등, 2003). 또한 B. amyloliquefaciens NJN-6이 생성하는 휘발성 물질(volatile compounds)로 F. oxysporum f. sp. cubense의 균사생장과 포자발아를 억제하였다(Yuan 등, 2012). 이는 길항미생물이 생성하는 항생물질과 활성효소 그리고 휘발성물질 등으로 발아를 억제하고 부착기를 만들지 못하게 하는 것으로 보인다. 따라서 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07을 활용하여 식물병원성 곰팡이의 발아를 억제하고 부착기 생성을 못하게 하는 것은 식물병원균의 침입 자체를 막아 효과적으로 병을 방제할 수 있는 방법이라 생각된다.

길항미생물의 활성효소 검정

길항미생물은 진균의 외막을 분해할 수 있는 가수분해효소를 이용하여 식물병원균의 세포벽을 분해시키는 용균작용을 통해 항균활성을 보인다. 따라서 항균활성을 보이는 3개의 균주에 대하여 세균이 내는 가수분해효소 중 cellulase와 protease의 활성을 갖는지 확인해 보았다. 그 결과 B. amyloliquefaciens GC07과 B. thuringiensis GC08은 cellulose를 분해하여 clear zone이 확인이 되었고, B. methylotrophicus GC02는 분해 능력이 없었다. 그리고 단백질이 포함된 배지를 이용하여 protease의 활성을 검정한 결과 3개 균주에서 모두 단백질을 분해하였다(Fig. 4). Bacillus spp. 가 분비한다고 알려진 효소들에는 amylases(Thippeswamy 등, 2014), proteases(Bhaskar 등, 2007), cellulase(Nakamura 등, 1987), chitinase(Watanabe 등, 1993), lipases(Nawani와 Kaur, 2000), 그리고 autolysin(Smith 등, 2000) 등이 있다. 특히, amylases, proteases, lipases 등의 효소들은 이미 산업적으로도 이용하고 있다(Barros 등, 2013). 본 연구에서 B. amyloliquefaciens GC07과 B. thuringiensis GC08은 cellulase와 protease의 활성은 비슷하였지만 대치배양을 통한 항균활성(Fig. 1)에서 차이를 보였다. 이것은 cellulase와 protease의 효소 이외의 다른 효소들과 생성되는 항생물질 차이에 의한 결과로 보이며, 추가연구를 통해 분비하는 항생물질에 대한 분석도 필요한 것으로 사료된다.

Fig. 4.

Characterization of bacterial substances produced by antagonistic microorganisms. Cellulase production was examined on CMC agar plates containing 1.2% carboxymethyl cellulose, followed by flooding with 0.1% congo red solution after 3 days. Protease production was examined on LB plates containing 3% skim milk after 3 days. Siderophore production and solubility capacity of phosphate were examined on CAS agar plates after 5 days and Pikovskaya’s agar plates after 15 days, respectively.


식물병원균에 대한 억제효과와 더불어 식물생장촉진에 도움을 주는 PGPR(Plant growth promoting rhizobacteria)의 역할을 할 수 있는지 알아보기 위하여 siderophore의 생성을 CAS 평판배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07에서 siderophore의 강한 활성을 나타내었다(Fig. 4). B. thuringiensis GC08은 비교적 적은 활성을 보여 밑둥썩음병원균의 대치배양 결과(Fig. 1)와 일치하는 결과를 나타내었다. 그리고 불용성 인산의 분해능력을 갖는지 알아보기 위하여 인산이 함유된 배지를 이용하여 검정하였다. 그 결과 siderophore 활성과 같은 3개 균주에서 모두 clear zone 을 보였지만 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07에서 강한 활성을 나타내었다(Fig. 4). 식물근권에 존재하는 길항미생물은 식물병원균의 생육을 저해하는 경쟁적 길항 작용의 일환으로 철(Fe3+) 성분 결합물질인 siderophore를 생산 하여 토양 전염병을 감소시키고 기주식물의 근권 정착능력을 촉진함으로써 식물의 성장을 촉진하여 수확량을 증대 할 수 있다(Bagg와 Neilands, 1987; Kloepper 등, 1980). 또한, 인산은 무기 인산염 형태로 토양에 시용되는 식물의 필수 양분이지만, 많은 부분이 불용화 되어 식물이 직접적으로 흡수할 수 없다. 식물에 반드시 필요한 인산은 화학비료를 이용하지만, 농작물의 생산가격을 높이고 토양의 영양성분 불균형을 초래하여 역효과를 낼 수도 있다(Patrick와 Khalid, 1974). 따라서 선발된 길항 미생물의 처리를 통해 난용성 인산염을 분해하여 식물이 직접적으로 사용가능한 영양원으로 가용화시켜 공급해줌으로써 생장촉진효과를 볼 수 있다(Rodrıguez와 Fraga, 1999). 본 연구 에서 분리된 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07은 siderophore에 강한 활성을 보이며 불용성 인산을 분해하여 항균작용뿐만 아니라 식물의 생장에도 도움을 줄 수 있을 것으로 보여진다.

길항미생물의 항균활성 범위

옥수수 밑둥썩음병을 일으키는 두 병원균 F. subglutinansF. temperatum은 유전적으로 매우 가까운 관계에 있다(Scauflaire 등, 2011). 따라서 옥수수 밑둥썩음병원균에 항균활성을 보인 세 균주의 적용범위를 알아보기 위하여 다른 식물병원성 진균들과 대치배양을 수행 하였다(Table 1). 시험에 사용된 식물병원성 진균들은 Sordariomycetes, Ascomycetes, Leotiomycetes로 서로 다른 강(Class)으로 선발하였다. Sordariomycetes에 시들음병을 발생시키는 F. oxysporum, 키다리병의 원인균인 F. fujikuroi, 도열병을 일으키는 Magnaporthe oryzae, 탄저병을 일으키는 Colletotrichum acutaum을 사용하였고, Ascomycetes에는 깨씨무늬병을 일으키는 Cochliobolus heterostrophus, 그리고 Leotiomycetes에 는 잿빛곰팡이병을 일으키는 Botrytis cinerea를 사용하였다. 그 결과 B. amyloliquefaciens GC07이 6가지 식물병원균에 대해 우수한 항균활성을 보였는데, 특이적으로 Sodariomycetes 에 속하는 종들에 더 강한 활성을 보였다(Table 1). 다음으로 B. methylotrophicus GC02도 폭넓은 항균활성 스펙트럼을 갖는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병을 포함한 다른 식물병원성 진균 방제에 적용 할 수 있을 것으로 판단되었다.

Antifungal effect of bacterial isolates against phytopathogens

PhytopathogensTreatmentGC02GC07GC08
Fusarium oxysporum+++a+++++
Fusarium fujikuroi++++++++
Magnaporthe oryzae+++++++++
Colletotrichum acutatum++++++++
Cochliobolus heterostrophus+++++++
Botrytis cinerea+++++++

aDetermined by measuring the average distance of inhibition zone; + for less than 0.5 cm, ++ for 0.5 to 1 cm, +++ for 1.0 to 1.5 cm, ++++ for 1.5 to 2.0 cm in distance of inhibition zone.


옥수수를 이용한 방제효과검정

선발된 길항미생물 3종과 옥수수 밑둥썩음병원균 2종을 옥수수에 동시 접종하여 방제효과를 검정하였다(Fig. 5). 옥수수 밑둥썩음병균의 병징은 줄기부분이 썩어 연한 갈색이 되고 세로로 갈색 줄무늬(brown streak)가 나타난다(Reid와 Zhu, 2004). 이러한 병징의 전반정도를 관찰한 결과 F. temperatum의 무처리구 disease index가 3.0으로 2.92의 F. subglutinans보다 강한 병원성을 갖는 것을 확인 하였다(Table 2). 이러한 결과는 F. temperatum의 균사생장이 더 빠르고 많은 포자를 생성하는 연구 결과와 일치하였다(Shin 등, 2014b). Fusarium spp.에 대한 길항미생물의 방제가를 알아보기 위해 동시 접종한 결과, B. amyloliquefaciens GC02와 B. methylotrophicus GC07은 F. subglutinans에 대하여 각각 87.2% 와 79.7%의 우수한 방제효과를 나타냈으며, B. thuringiensis GC08은 61.5%의 낮은 방제효과를 나타내었다. 그리고 F. temperatum에 대해서는 B. amyloliquefaciens GC07이 72.7%의 높은 방제효과를 보였으며, B. methylotrophicus GC02는 69.1%, B. thuringiensis GC08은 가장 낮은 36.1%로 나타났다. 이러한 결과는 대치배양을 통한 균사생장억제효과 검정(Fig. 1)과 발아억제효과 검정(Fig. 2) 결과와 일치함을 알 수 있었다.

Control efficiency of bacterial isolates against Fusarium subglutinans and F. temperatum on corn stalk

TreatmentF. subglutinansF. temperatum


Disease severityaControl efficiency (%)cDisease severityControl efficiency (%)
GC020.58 ± 0.14ab79.7 ± 6.2a0.92 ± 0.14a69.1 ± 7.0a
GC070.42 ± 0.14a87.2 ± 4.4a0.75 ± 0.00a74.9 ± 2.1a
GC081.25 ± 0.25b61.5 ± 7.7b1.92 ± 0.14b36.1 ± 2.6b
Control2.92 ± 0.29c-3.00 ± 0.25c-

aDisease severity was measured based on lesion size and assessed on a 0-4 scale, where 0, 0%; 1, 1-25%; 2, 26-50%; 3, 51-75%; and 4, 76-100% lesions.

bValues are means ± standard errors, calculated from three independent observations. Those sharing the same letter are not significantly different, based on the Duncan’s multiple range test at p = 0.05.

cControl efficiency = (control disease severity - treatment/control) × 100


Fig. 5.

In vivo pathogenicity assay of bacterial strains from corn on the development of stalk rot caused by Fusarium subglutinans and F. temperatum. Corn were grown for 3-4 weeks. Bacterial culture suspension were pipette injection, and then were pipette injection of conidia suspension with a concentration of 4×104conidia/ml. After 10 days, this result was evaluated.


지난 10여 년간 식물생육촉진근권세균(PGPR)을 이용하여 화학살균제를 대체하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 내생포자(endospore)를 형성하여 살균제만큼 장기간 보존이 가능한 Bacillus spp.에 대한 개발이 증가하고 있다(Borriss, 2011; Qiao 등, 2014). 본 연구에서 옥수수 밑둥썩음병 2 종(F. subglutinans and F. temperatum)에 우수한 항균활성을 보이는 균주는 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07 으로 나타났다(Fig. 1). B. amyloliquefaciens는 기존에 cycliclipopeptide계를 포함한 다양한 항생물질들과 항균기작에 대한 연구가 진행 되었으며(Arrebola 등, 2010; Chen 등, 2010; Sun 등, 2006), B. methylotrophicus에 대한 연구는 상대적으로 거의 전무하다. 최근에 Madhaiyan 등(2010)에 의해 호기성, 간균형으로 내생포자를 형성한다고 보고했으며, B. methylotrophicus strain BC79가 phenaminomethylacetic acid를 분비하며, 다양한 식물병원성 진균의 균사생장과 포자 발아를 억제한다는 연구가 보고되었다(Shan 등, 2013).

길항미생물의 항생물질에 의한 병원성 미생물 생장 억제와 더불어, 길항미생물은 시데로포어(Siderophore)의 생산, 불용성인산의 분해(Phophate solubilization), 질소고정능력 (Nitrogen fixation), ACC(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase)의 생산, 쿼럼센싱(quorum sensing) 신호교란이나 생물막(biofilm) 합성 저해, 휘발성 유기물질생산 그리고 병원균 독소생성 억제 등을 통하여 병원성 미생물을 억제하거나 식물의 생장을 촉진하는 것으로 알려져 있다(Bhattacharyya 와 Jha, 2012). 본 연구에서 다양한 식물병원균에 우수한 항균 활성을 보인 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07는 높은 시데로포어의 활성을 나타났다(Fig. 4). 시데로포어는 salicylic acid 또는 jasmonic acid와 ethylene 등 식물호르몬 생산을 유도하여 식물의 유도전신저항성(Induced systemic resistance)을 일으키는 역할을 하는 것으로도 알려져 있다 (Annapurna 등, 2013; Beneduzi 등, 2012). 따라서 옥수수에 발생하는 밑둥썩음병 방제를 위해 등록된 살균제가 없는 가운데 건전한 옥수수 근권에서 분리한 B. methylotrophicus GC02와 B. amyloliquefaciens GC07을 이용하여 옥수수 밑둥썩음병 방제 및 친환경농업에 적용할 수 있을 것으로 보이며, 추후 포장시험을 통한 미생물제제로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.

Acknowledgement

This study was supported by a grant (PJ00932405) from Rural Development Administration, Golden Seed Project (213001-04-1-SBA10) by Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (MAFRA), Ministry of Oceans and Fisheries (MOF), Rural Development Administration (RDA), and Korea Forest Service (KFS), and BioHerb Research Institute, Kangwon National University, Republic of Korea.

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September 2019, 25 (3)