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Characterization of Brugmansia mosaic virus Isolated from Brugmansia spp. in Korea
Res. Plant Dis. 2014;20:307-313
Published online December 15, 2014
© 2014 The Korean Society of Plant Pathology.

Chung Youl Park1, Bong-Sub Kim1, Moon Nam1, Min-A Lee1, Da-Som Baek1, Yang Su Bae1, Eun-Hye Park1, Jeong-Sun Kim3, Jong-Yoon Choi4, Seungmo Lim5,6, Jae Sun Moon5,6 and Su-Heon Lee1,2*

1School of Applied Biosciences, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
2Institute of Plant Medicine, Kyungpook National University, Daegu 702-701, Korea
3Agricultural Microbiology Division, National Academy of Agricultural Science, Rural Development Administration, Wanju 565-851, Korea
4Apple Research Station, National Institute of Horticultural & Herbal Science, Gunwi 716-812, Korea
5Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology (UST), Daejeon 305-350, Korea
6Plant Systems Engineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Daejeon 305-806, Korea

Su-Heon Lee

Tel : +82-53-950-5763
Fax: +82-53-950-6758
E-mail: suheon@knu.ac.kr

Received October 28, 2014; Revised November 25, 2014; Accepted December 3, 2014.
cc This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

In May 2013, an angel’s trumpet leaves showing mosaic and malformation symptoms were collected from Suwon city, Gyeonggi-do. An analysis of the collected sample by transmission electron microscopy observation showed filamentous rod particles of 720-800 nm in length. On the basis of the these observations, we performed PCR against three reported Potyviruses (Brugmansia mosaic virus, Colombian datura virus and Brugmansia suaveolens mottle virus), and the sample was positive for BruMV. Pathogenicity and host range test of BruMV was determined by mechanical inoculation. Solanaceae (tobacco, tomato and eggplant) and Amaranthaceae (ground cherry) appeared typical virus symptoms. To determine coat protein of this virus, we designed specific primer pairs, and performed PCR amplification, cloning, and sequencing. Phylogenetic analysis showed that BruMV-SW was most closely related to BruMV isolate SK. Comparison of the BruMV-SW coat protein nucleotide sequences showed 92% to 99% identities to the other BruMV isolates.

Keywords : Angel’s trumpet, Bioassay, Brugmansia, Potyvirus
브루그만시아(Brugmansia spp.)는 천사의 나팔꽃(Angel’s trumpet)으로 알려져 있으며, 꽃 모양과 색깔 등의 화려함 때문 에 주로 관상용으로 이용되는 가지과 독말풀 속의 다년생 관목 식물이다(Chellemi 등, 2011; Lucinda 등, 2010). 브루그만시아 는 남아메리카가 원산지이고 현재는 북미, 아프리카, 호주, 아 시아 등 전 세계적으로 분포하고 있으며, 7종(Brugmansia arborea, Brugmansia aurea, Brugmansia insignis, Brugmansia sanguinea, Brugmansia suaveolens, Brugmansia versicolor, Brugmansia vulcanicola)의 야생종이 보고되어 있다(Bailey와 Bailey, 1976; Chellemi 등, 2011). 종간의 교배, 증식, 보급이 간편하다 는 특성 때문에 현재까지 알려진 교배종은 약 200종 이상 되는 것으로 추정되고 있다(Vernon 등, 2013). 브루그만시아는 모 든 부위, 특히 씨와 잎은 아트로핀(atropine), 스코폴라민(scopolamine), 알카로이드(alkaloid) 등과 같은 유독성 물질을 함 유하고 있기 때문에 즙액을 섭취하거나 접촉하게 되면 메스꺼 움, 구토, 피부부종 등을 유발하는 것으로 알려져 있다(Bristol, 1969; Evans와 Lampard, 1972). 한편, 최근 보고된 연구에 따르 면 위의 유독성 물질들은 파키슨병(Parkinson’s disease), 심장 병(Caridac problems)과 같은 인체 병의 치료제로써 특성을 가 지고 있는 것으로도 보고되고 있다(Lorenzi와 Souza, 2001). 현재까지 브루그만시아 종(species)에서 동정된 바이러스병 은 5종으로, Brugmansia mild mottle virus(BrMMV, Tobamovirus) (Ilmberger 등, 2007), Colombian datura virus(CDV, Potyvirus) (Salamon와 Palkovics, 2005), Brugmansia suaveolens mottle virus(BsMoV, Potyvirus)(Lucinda 등, 2008), Brugmansia mosaic virus(BruMV, Potyvirus)(Damsteegt 등, 2013), Tomato spotted wilt virus(TSWV, Tospovirus)(Nikoli? 등, 2013)가 보고되어 있으 며, 국내에서는 BruMV(Fumei 등, 2013)와 TSWV(Choi 등, 2014) 2종이 보고되었다. 국내에서 BruMV는 대전에서 채집된 브루그 만시아에서 최초 발견되었으며, 전체 염기서열과 일부 지표식 물 반응이 보고되었다(Fumei 등, 2013). 또한 BruMV는 2013년 미 국과 국내에서 거의 동시에 발견된 신종바이러스로서, 아직까 지 생물학적 특성은 거의 구명되어 있지 않다. 국내에서 외래식 물인 브루그만시아는 대부분 비공식적으로 수입된 것으로 추 정되며, BruMV의 병원성과 다른 작물로의 확산가능성에 대한 연구는 전무한 실정이다. 본 연구에서는 2013년 5월 경기도 수 원시에서 잎에 모자이크와 기형의 증상을 보이는 브루그만시 아를 채집하여(Fig. 1), 전자현미경 검경과 외피단백질 유전자 염기서열 분석을 통하여 BruMV를 동정하였으며, 이 분리주를 BruMV-SW로 명명하였으며, 지표식물과 주요 작물에서 병원성 분석을 실시하였다.

 전자현미경 검경. 전형적인 바이러스 병징을 보이는 브루 그만시아 잎 조직을 매질염색(direct negative staining) 방법 을 이용하여(Horne와 Wildy, 1963) 바이러스 입자를 관찰하였 다. 소량의 잎 조직을 절취한 뒤 멸균된 유발에 인산칼륨완충 액(potassium phosphate buffer, pH 7.0)를 첨가한 후 마쇄하 여 즙액을 추출하였다. 폼바막(Formvar film)을 씌운 grid(200 mesh)에 즙액을 1분 30초간 적신 뒤, 2.5% phosphotungstic acid(PTA, pH 7.2)를 1 μl를 분주한 뒤 2분간 침지시킨 후 여액을 제거하고 투과전자현미경(CARL ZEISS LE0912AB, Germany)으 로 관찰하였다.

 기주범위 및 병원성 분석. 병원성 검정과 기주범위 결정을 위하여 감염된 브루그만시아 잎 조직에 100배(W/V)의 0.01 M 인 산칼륨완충액을 첨가하여 마쇄한 뒤 silicon carbide(400 mesh; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 즙액접종하였다. 지표식물은 7과 33종을 사용하여 3반복 수행한 후, 8주간 접종엽과 상엽, 줄 기에서의 병징을 관찰하였다. 또한, 감염은 되었으나 병징 발현 이 되지 않는 식물체를 고려하여 생물검정에 이용한 모든 지표 식물에 대하여 RT-PCR 검정을 실시하였다.

 cDNA 합성 및 PCR 진단. 채집된시료의종동정을위하여 병 징이 강하게 나타난 브루그만시아 잎으로부터 전체 RNA(Total RNA)를 추출하였다. 전체 RNA는 TRI Reagent(Molecular Research Center, USA)를 이용하여 공급사의 매뉴얼에 따라 50 μl를 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 RN25(5’-NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN N-3’) 프라이머와 TOPscript™ Reverse Transcriptase(Enzynomics, Korea)를 사용하여 cDNA를 합성한 뒤 PCR 증폭의 주형(Template)으로 사용하였다. PCR 증폭은 BsMoV, BruMV, CDV 3종에 대한 특이적 프라이머(Table 1) 를 이용하여 Lim 등(2014)의 방법을 이용하였다.

외피단백질 유전자 염기서열 분석. 외피단백질 영역을 증 폭하기 위하여 NCBI Genbank에 등록되어 있는 BruMV 2개의 분리주(Genbank accession no. NC020105, JX874139)의 공통 된 염기서열로부터 특이적 프라이머를(BruM-CP-F: 5’-CTG AGC TTG 
CAC TGA AGA-3’ & BruMV-CP-R: 5’-GAT TTG GCA TCA GAA GGG-3’) 설계하였다. 염기서열 결정은 설계된 프라이머를 이용하여 증폭된 PCR 산물 1,182 bp를 정제 후 이 등(2010)의 방법으로 클로닝을 수행한 뒤 솔젠트(SolGent, Korea)에 염기서 열 결정을 의뢰하였다. 결정된 염기서열은 DNAMAN 7.0(Lynnon Biosoft, Canada) 프로그램을 이용하여 유연관계 분석을 실시하 였다.
 채집한 시료 1주를 전자현미경으로 검경한 결과, 720-800 nm 길이의 사상형 입자가 관찰되었다(Fig. 2). 이를 토대로 본 시료 에 감염된 바이러스는 Potyvirus 속의 종으로 사료되어 진단용 프라이머를 이용하여 3종의 기보고 바이러스에 대하여 PCR을 수행한 결과, BruMV로 진단되었다. 
 BruMV에 감염된 브루그만시아 잎 조직을 마쇄하여 추출한 즙액을 접종원으로 사용하여 7과 33종 지표식물에 기계적 접 종하여 병원성과 기주범위를 확인하였다. 생물검정 결과 Petunia hybrida를 포함한 9종의 담배에서 국부감염 되었으며, 천일홍 (Gomphrena globosa)을 포함한 17종의 지표식물에서 전신감 염을 확인하였다. 비름과(Amaranthaceae) 속의 천일홍의 경우 무병징(symptomless)을 나타냈고, RT-PCR을 이용하여 진단한 결과 최종 감염을 확인하였다. 농업적으로 중요한 작물 중 하나 인 토마토(Lycopersicon esculentum)와 가지(Solanum melongena) 에서는 각각 모자이크(mosaic)와 괴저반점(necrotic spot)의 증 상을 보였다. Nicotiana benthamiana에서는 접종 후 14일 뒤 백 화(chlorosis) 증상을 보였고, 병이 진전됨에 따라 황화(yellowing) 병징이 나타났다. N. clevelandiiN. occidentalis에서는 접 종 후 7일 후 괴사(necrosis) 되었으며, N. glutinosaN. rustica 는 모자이크 병징이 관찰되었다(Fig. 3). 이외에 동일한 가지과 (Solanaceae) 속의 고추(Capsicum annuum)와 독말풀(Datura stramonium)에서는 병징이 관찰되지 않았다. 또한, 명아주과 (Chenopodiaceae)에속하는붉은명아주(Chenopodium amaranticolor) 와 흰명아주(C. quinoa), 석류풀과(Aizoaceae)의 번행초(Tetragonia tetragonoides)에서는 병징이 나타나지 않았다. 경제적으 로 중요한 작물중 하나인 박과(Cucurbitaceae) 작물에서는 참외 (Cucumis melo var. makuwa), 수박(Citrullus vulgaris), 오이(Cucumis sativus), 박(Lagenaria leucantha), 호박(Cucurbita pepo), 멜론(Cucumis melo), 십자화과(Brassicaceae) 속의 갓(Brassica juncea), 콩과(Leguminosae)에 속하는 강낭콩(Phaseolus vulgaris), 완두(Pisum sativum), 동부(Vigna unguiculata), 팥(Phaseolus angularis) 총 14종 지표식물에서는 병징이 나타나지 않았다. 생 물검정에 이용된 모든 식물체에 대해서는 RT-PCR을 수행하여 최종적으로 감염을 확인하였다(Table 2).
외피단백질 영역 증폭을 위하여 제작된 특이적 프라이머를 이용하여 PCR, 클로닝, 염기서열 분석을 수행한 결과 1,182개 의 뉴클레오타이드(nucleotide, nt)를 확인하였다. NCBI BLAST 를 이용하여 외피단백질 영역만을 분석하였고, 이를 NCBI에 등 록하였다(GenBank accession no. AB851482). 분석된 염기서열 과 NCBI GenBank에 보고되어 있는 Potyvirus 속 19종의 바이러 스를 이용하여 유연관계 분석을 실시한 결과, 국내에서 보고된 BruMV SK 분리주와 가장 높은 유사성을 보였다(Fig. 4). DNAMAN 프로그램의 Observed Divergency를 이용하여 외피단백 질 상동성을 분석한 결과 SK 분리주와 99% 뉴클레오타이드 상동성을 보였고, 미국 D-437 분리주와 92% 상동성을 보였다. 위 의 계통수 분석과 염기서열 상동성 분석 결과를 토대로 수원에 서 채집된 BruMV SW 분리주는 국내에서 보고된 SK 분리주와 밀접한 관련이 있을 것으로 사료된다. 추가적으로 BruMV의 종 자전염 가능성을 고려하여 즙액 접종시켜 전신감염 된 담배 7 종에서 종자를 수확하여 RT-PCR 분석을 실시하였지만 모두 음 성반응을 보였다(자료 미제출). 국내에서 브루그만시아는 전국 에 분포되어 있으며, BruMV가 매개체에 의해 확산이 된다면 토 마토, 가지, 담배 등의 작물에 큰 피해를 줄 것으로 예상된다. 따 라서, 브루그만시아에 대한 지속적인 모니터링이 필요할 것으로 사료되며, 국내 유입경로에 대한 연구가 필요할 것으로 생각 된다.
요 약
2013년 5월, 경기도 수원시에서 모자이크와 기형의 병징을 보이는 천사의 나팔꽃 잎을 채집하였다. 채집한 시료는 전자현 미경을 이용하여 검경한 결과 720-800 nm 길이의 사상형 입 자가 관찰되었다. 전자현미경 검경 결과에 근거하여 기보고된 3종의 바이러스(Brugmansia mosaic virus, Colombian datura virus, Brugmansia suaveolens mottle virus)에 대하여 RT-PCR을 수행하였으며, BruMV에 양성반응을 보였다. 기계적 접종을 이 용하여 BruMV의 병원성과 기주범위를 결정하였다. 가지과(담 배, 토마토, 가지)와 비름과(땅꽈리)에서 전형적인 바이러스 병 징이 나타났다. BruMV의 외피단백질을 결정하기 위하여 특이 적 프라이머를 설계하였고, PCR, 클로닝, 시퀀싱을 수행하였다. 계통수 분석 결과, BruMV-SW는 BruMV SK와 가장 유사한 것으 로 나타났다. 외피단백질을 이용한 뉴클레오타이드 상동성 비 교에서는 BruMV 분리주와 92%와 99%의 상동성을 보였다.
Acknowledgements
This research was supported by a grant from the Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009033), Rural Development Administration, Republic of Korea and by a grant from the Animal and Plant Quarantine Agency (QIA), Ministry of Agriculture, Republic of Korea (Project Code No. Z-1542051-2013-15-01).
Figures
Fig. 1. Symptoms caused by Brugmansia mosaic virus isolate SW (BruMV-SW) in the greenhouse. A: Brugmansia sp. plant showed mosaic, malformation
(turtle-shape), B: Enlarge of A, C: Enlarge of B.
Fig. 2.  Particles of Brugmansia mosaic virus (BruMV) isolate SW in Brugmansia sp. naturally infected. A, B, C; filamentous rod shape virions are
present in direct negatively strained with phosphotungstic acid (PTA) from symptomatic leaf tissue and analyzed by an electron microscopy (EM).
Scale bar represents 200 nm.
Fig. 3. Symptoms produced on test plants infected with Brugmansia mosaic virus isolate SW (BruMV-SW). A: Petunia hybrida - mosaic and necrotic
spots, B: Nicotiana glutinosa - mosaic, C: N. rustica - severe mosaic; D: N. tabacum cv. Samsun - mosaic and necrotic ring spots; E: N. tabacum cv.
Xanthi NC - mosaic and necrotic spots; F: N. tabacum cv. Xanthi - mosaic and necrotic spots; G: N. tabacum cv. Bright yellow - chlorosis spots, H: N.
benthamiana - chlorosis and yellowing; I: N. occidentalis - necrosis; J: Lycopersicon esculentum - mosaic; K: Solanum melongena - necrotic spots, L:
Physalis floridana - mosaic.
Fig. 4.  Phylogenetic tree calculated from the nucleotide (A) and amino acid (B) sequences of the coat protein of BruMV-SW and published species
of the 19 Potyviruses. The abbreviations of virus names and GenBank accession number used in the phylogenetic tree analysis: Pepper mottle virus
(PepMoV; EU586128), Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV; NC0145361), Peru tomato virus (PTV; AJ516010), Potato virus V (PVV; NC004010),
Wild potato mosaic virus (WPMV; NC004426), Pepper yellow mosaic virus (PepYMV; NC014327), Bidens mottle virus (BiMoV; EU250210), Verbena virus
Y (VVY; NC010735), Pepper severe mosaic virus (PeSMV; NC008393), Potato virus Y (PVY; EF026075), Sunflower chlorotic mottle virus (SuCMoV;
NC014038), Narcissus yellow stripe virus (NYSV; NC011541), Turnip mosaic virus (TuMV; NC002509), Lettuce mosaic virus (LMV; NC003605), Celery
mosaic virus (CeMV; NC015393), Panax virus Y (PanVY; GQ916624), Leek yellow stripe virus (LYSV; NC004011), Brugmansia mosaic virus (BruMV;
JX874139 (SK isolate), AB851482 (D-437 isolate)). 
Tables
Table. 1.  Primer names, oligonucleotide sequences and expected sizes of primer sets used in PCR reactions 

Table. 2. Host range and symptoms of Brugmansia mosaic virus isolate SW 
a
Inoculation leaf/Upper leaf. Chl, Chlorosis; CS, Chlorotic spot; LLc, Chlorotic local lesion; LLn, Necrotic local lesion; M, Mosaic; N, Necrosis; NS,
Necrotic spot; Necrotic ring spot, Rsn; S, Symptomless; Y, Yellowing.
b
(○): Positive reaction, (-): negative reaction.

References
  1. Bailey, L. H. and Bailey, E. Z. 1976. Hortus Third. A concise dictionary of plants cultivated in the United States and Canada. Pub, Co., Inc., New York, 1290 pp.
  2. Bristol, M. L. 1969. Tree Datura drugs of the Colombian Sibunoy. Botanical Museum Leaflets, Harvard University. 22: 165-227.
  3. Chellemi, D. O., Webster, C. G., Baker, C. A., Annamalai, M., Achor, D. and Adkins, S. 2011. Widespread occurrence and low genetic diversity of Colombian datura virus in Brugmansia suggest an anthropogenic role in virus selection and spread. Plant Dis. 95: 755-761.
    CrossRef
  4. Choi, S.-K., Cho, I.-S., Choi, G.-S. and Yoon, J.-Y. 2014. First report of Tomato spotted wilt virus in Brugmansia suaveolens in Korea. Plant Dis. 98: 1283.2.
  5. Evans, W. C. and Lampard, J. F. 1972. Alkaloids of Datura suaveolens. Phytochemistry 11: 3293-3298.
    CrossRef
  6. Horne, R. W. and Wildy, P. 1963. Virus structure revealed by negative staining. Advan. Virus Res. 10: 101-170.
    CrossRef
  7. Ilmberger, N., Willingmann, P., Adam, G. and Heinze, C. 2007. A Subgroup 1 Tobamovirus Isolated from Brugmansia sp. and its Detection by RT-PCR. J. Phytopathology 155: 326-332.
    CrossRef
  8. Lee, J. H., Park, S. J., Nam, M., Kim, M. J., Lee, J. B., Sohn, H., Choi, H. S., Kim, J.-S., Lee, J.-S., Moon, J.-S. and Lee, S.-H. 2010. Identification of a New Potyvirus, Keunjorong mosaic virus in Cynanchum wilfordii and C. auricilatum. Res. Plant Dis. 16: 238-246. (In Korean)
    CrossRef
  9. Lim, S., Zhao, F., Yoo, R. H., Igori, D., Lee, S. H., Lim, H. -S. and Moon, J. S. 2014. Characteristics of a Lettuce mosaic virus isolate infecting lettuce in Korea. Plant Pathology J. 30: 183-187.
    Pubmed KoreaMed CrossRef
  10. Lorenzi, H. and Souza, H. M. 2001. Plantas ornamentais do Brasil, 3rd ed. Nova Odessa, SP, Instituto Plantrum de Estudos da Flora Ltda. 1088 pp.
  11. Lucinda, N., Inoue, N.-A. K., Kitajima, E. W. and Nagata, T. 2010. Complete genome sequence of Brugmansia suaveolens mottle virus, a Potyvirus from an ornamental shrub. Arch Virol. 155: 1729- 1732.
    Pubmed CrossRef
  12. Lucinda, N., Nagata, T., Inoue, -N. A. K., Salaroli, R. B. and Kitajima, E. W. 2008. Brugmansia suaveolens mottle virus, a novel potyvirus causing leaf mottling of Brugmansia suaveolens in Brazil. Arch Virol. 153: 1971-1976.
    Pubmed CrossRef
  13. Nikoli?, D., Stankovi?, I., Vu?urovi?, A., Risti?, D., Milojevi?, K., Bulaji?, A. and Krsti?, B. 2013. First Report of Tomato spotted wilt virus on Brugmansia sp. in Serbia. Plant Dis. 97: 850.1.
  14. Salamon, P. and Palkovics, L. 2005. Occurrence of Colombian datura virus in Brugmansia hybrids, Physalis peruviana L. and Solanum muricatum Ait. in Hungary. Acta Virol. 49: 117-122.
    Pubmed
  15. Zhao, F., Lim, S., Yoo, R. H., Lim, H.-S., Kwon, S.-Y., Lee, S.-H. and Moon, J. S. 2013. Complete genome sequence of a South Korean isolate of Brugmansia mosaic virus. Arch Virol. 158: 2019- 2022.
    Pubmed CrossRef


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